聚丙烯酰胺类油田添加剂生物毒性测试方法*

马 跃， 宫 琦， 李术元， 赖晓晴

(1. 中国石油大学 理学院， 北京 102249； 2. 中国石油集团工程技术研究院有限公司 钻井液所， 北京 102206)

自1954年聚丙烯酰胺在美国实现商业化生产以来，大量丙烯酰胺类聚合物改性产品应用于污水处理、石油开采和医药开发等领域，随着聚丙烯酰胺在自然环境中的老化降解，其降解产物具有较高毒性，一定程度上污染了自然环境[1-3].而钻井液中使用的包被剂、增粘剂、降滤失剂等基本都是丙烯酰胺类聚合物[4-5]，因此，丙烯酰胺类聚合物产品作为油田添加剂受到了质疑.Sickles等[6]研究表明，丙烯酰胺具有生殖毒性，降低蛋白质活性，影响细胞的有丝分裂和减数分裂，从而引起生殖损伤.也有研究[7-9]表明，油炸食品中的微量丙烯酰胺可致癌，且长期接触丙烯酰胺类物质还会导致“肌无力”等症状的产生，这是因为丙烯酰胺的毒性损害了神经系统.聚丙烯酰胺类油田添加剂的“环保”排放成为亟待解决的问题，而生物毒性是表征其环保性能的重要指标之一.

自20世纪70年代以来，利用生物监测器对环境中的污染物进行风险评价成为环境科学技术领域的研究热点[10-13].发光菌测试方法具有快速、灵敏、简便、价廉等优点，因而被广泛用于排放样品的生物毒性测试中[14-16].近两年，用于《水溶性油田化学剂环境保护技术评价方法》(SY6788-2010)中的明亮发光杆菌T3小种冻干粉价格暴涨，且供货不稳定.本文以费氏弧菌替代国标菌种并将其作为测试对象，以发光强度和抑制率为考核指标，通过一系列实验考察费氏弧菌的稳定性，研究不同浓度的参比毒物对菌种发光强度和抑制率的影响，进而评价聚丙烯酰胺类油田添加剂的生物毒性.本文测试方法简单方便，所用原料价格低廉，有效解决了发光杆菌T3小种价格昂贵、供货不稳定的问题.此外，与国标中的氯化汞相比，参比毒物ZnSO4·7H2O能够显著降低毒性，并有助于开展油田添加剂的生物毒性机理研究.

1 实 验

1.1 实验仪器

所用实验仪器包括产自湖南碧霄环境科技有限公司的BX-ATA-P型生物毒性测试仪、产自Thermo公司的不同量程精密移液器、产自凌拓(北京)化工玻璃仪器有限公司的不同量程容量瓶、烧杯、塑料瓶等.

1.2 实验材料

实验材料包括产自湖南碧霄环境科技有限公司的发光菌试剂盒(费氏弧菌)以及产自国药集团化学试剂有限公司的ZnSO4·7H2O(分析纯)和NaCl(分析纯).聚合物包被剂在钻井过程中可以起到有效分散钻屑的作用，聚合物降滤失剂则可以起到防止滤失过大的作用.本实验所用的包被剂和降滤失剂均为聚丙烯酰胺类聚合物，由新疆玛湖和黑龙江大庆油田某些原料配制而成.高粘甲基纤维素CMC-Hv与聚阴离子纤维素PAC-Hv均为天然产品，分别购自廊坊市新兴化工有限公司和宜兴市通达化学有限公司，聚合物XC为生物合成聚合物.

1.3 实验方法

1.3.1 实验类别

1) 阴性质控实验：相当于空白实验，以2%NaCl溶液为测试样品，理想状态下其抑制率为0%.

2) 阳性质控实验：标准品为阳极参比毒物(ZnSO4·7H2O)，理想条件下其抑制率为100%.

3) 样品测定实验：共对8种物质进行发光细菌毒性测定，每一个样品需要一根试管(需按顺序标号).

1.3.2 冻干菌复苏液配置

吸取1 mL冻干菌复苏液(冷NaCl溶液)，滴加到装有冻干菌的小试管中摇匀(约1 min)，进行生物细菌冻干菌的复苏，复苏温度稳定在2～4 ℃.静置3～5 min后，在暗室内可以肉眼观测到蓝绿色荧光，再利用渗透压调液配置出20 mL冻干菌复苏液(稀释菌液).

1.3.3 发光强度测试与抑制率计算

准备若干支透明测试管并按顺序编号.首先向每一只空测试管中各加入0.5 mL稀释菌液，平衡静置3～5 min后，再测试其初始发光强度.在上述已经加入稀释菌液的测试管中，继续加入0.5 mL待测样品，设置反应时间，按照加样的顺序依次测定各测试管的发光强度.利用发光强度计算冻干菌的抑制率，相应计算表达式为

IR=(P0-P1)/P1×100%

式中：P0为初始发光强度；P1为检测发光强度.

2 结果与讨论

2.1 费式弧菌发光稳定性测试

为了验证费式弧菌具有稳定的发光能力，同时考虑到室温不稳定会影响测量结果的准确性，因此，在恒温20 ℃下测量费式弧菌在阴性质控实验中的发光强度，实验中每2.5 min取一个测试点，直到30 min后结束实验，共进行三组实验，所得结果如图1所示.图1中RLU为相对发光强度单位，其数值随着测试设备的型号变化而改变.

图1 不同暴露时间对费氏弧菌发光强度的影响Fig.1 Effect of different exposure time on luminous intensity of vibrio fischeri

由图1可见，在30 min内随着暴露时间的增加，费式弧菌的生物活性逐渐降低，但降低趋势很平缓，仍然具有较好的生物活性.可见，在20 ℃下费式弧菌存活状态较好，未过多受到温度的干扰.图1中三组冻干菌复苏时的初始发光强度分别为14.4×105、12.9×105、11.6×105RLU，即均具有很好的初始发光强度，这证明了费式弧菌无论是在运输途中还是在冰箱保存过程中，都不易失去生物活性，因而具有较好的稳定性.观察图1可以发现，在30 min测量时间内，费式弧菌的发光强度未出现明显下降，表明费式弧菌在测量过程中自然死亡率不高，且所测数据处于生物体实验误差范围内.

2.2 参比毒物浓度的影响

依据ISO 11348-3标准方法要求，选择易溶、稳定、常见、价廉、对人和环境危害小的ZnSO4·7H2O为毒性参照物，考察了不同浓度ZnSO4·7H2O对费式弧菌发光强度的影响，结果如图2所示.

图2 不同浓度ZnSO4·7H2O对费氏弧菌发光强度的影响Fig.2 Effect of ZnSO4·7H2O at different concentrations on luminous intensity of vibrio fischeri

由图2可见，不同暴露时间下不同浓度ZnSO4·7H2O对费氏弧菌发光强度具有较大影响.当ZnSO4·7H2O浓度达到5 mg/L时，费氏弧菌发光强度开始明显下降；当ZnSO4·7H2O浓度达到15～20 mg/L时，发光强度显著下降，表明毒性参照物ZnSO4·7H2O的浓度越大，其对费氏弧菌发光强度影响越大，也就是其抑制率越高.这是因为Zn2+浓度越大，对费氏弧菌产生细菌荧光素酶的影响越大，因而测得的发光强度越小.当Zn2+浓度超过4.55 mg/L、暴露时间达到30 min时，费氏弧菌抑制率达到了96.0%，几乎接近于100%的致死浓度.

2.3 20 mg/L ZnSO4·7H2O的影响

ISO 11348-3标准中规定的ZnSO4·7H2O参考浓度为19.34 mg/L，因此，有必要研究发光菌在20 mg/L ZnSO4·7H2O中发光强度随时间的变化规律.配置20 mg/L ZnSO4·7H2O作为参比毒物，研究该浓度ZnSO4·7H2O作用下费氏弧菌的发光强度和抑制率，结果如图3所示.

图3 ZnSO4·7H2O对费式弧菌发光强度和抑制率的影响Fig.3 Effect of ZnSO4·7H2O on luminous intensity and inhibition rate of vibrio fischeri

《水溶性油田化学剂环境保护技术评价方法》(SY6788-2010)标准要求：相同浓度毒性参照物的相对标准偏差需要控制在10%以内.由图3可见，浓度为20 mg/L的ZnSO4·7H2O溶液的5 min发光抑制率为60%，15 min发光抑制率为91%，30 min发光抑制率为95%.由此可见，5 min和15 min发光抑制率测试结果差异较大，而15 min发光抑制率为生物活性趋于平缓的转折点，表明利用ZnSO4·7H2O进行阳性质控实验时，应该在测试过程中选择15～30 min作为测试时间，从而缩小误差.

2.4 油田添加剂生物毒性测试

在20 ℃下对油田添加剂的生物毒性进行测试，结果如表1所示.表1中的添加量均为现场实验中在保证实验效果的前提下所需的最小添加量.

表1 油田添加剂的生物毒性测试结果Tab.1 Test results of biological toxicity of oil field additives

由于受到合成与自然降解条件的影响，表1中实验数据存在较小偏差.聚合物包被剂和降滤失剂均为聚丙烯酰胺类产品，皆由实验室配置(具体成分涉密).理想状态下样品发光抑制率不受暴露时间的影响，且处于相同环境下的实验样品受到自然死亡的影响也相同.由表1可见，实际上油田添加剂生物毒性随暴露时间的延长而增大.相同暴露时间内，样品包被剂-2毒性最大，包被剂-3毒性最小，而样品降滤失剂-1和降滤失剂-4均为剧毒，降滤失剂-3毒性最小.当暴露时间为15 min时，复苏过程导致发光抑制率还不稳定，因而具有较大误差.当暴露时间由15 min延长到45 min时，发光菌抑制率均有所提高，但提高幅度相对较小.当暴露时间由45 min延长到180 min时，发光菌抑制率显著提高.由于费氏弧菌在室温下存在自然死亡现象，因而难以进行长时间测定.根据不同浓度ZnSO4·7H2O对费式弧菌发光强度的影响结果可知，15～30 min暴露时间段内费氏弧菌发光强度曲线走势趋于平稳，因而15～30 min为较合适的测定时间.观察表1可以发现，聚合物包被剂毒性较小，这是因为包被剂为丙烯酸和丙烯酰胺聚合物，分子量通常高于100万，在钻井液中添加范围为0.2%～0.5%，由于添加量较小，因而其对毒性影响相对较小.聚合物降滤失剂由丙烯酰胺、丙烯酸和2-甲基丙磺酸单体聚合组成且毒性较大，这是因为其在钻井液中添加量较大，需要引入更多基团或其他成分达到抗温、抗盐的目的，因此，其在生物毒性评价过程中的整体发光抑制率偏高.聚合物降滤失剂-3是一种低毒型产品，其余三种产品均为重毒或剧毒产品，此类型聚合物降滤失剂应用于钻采过程中会严重威胁土壤土质和地下水的清洁，过多使用会破坏生态平衡.CMC-Hv、PAC-Hv和XC皆为大分子纤维素或天然产品合成产物，毒性较弱，比较环保.综上所述，费氏弧菌发光抑制率可用于油田添加剂生物毒性的评价，同时也可用于土壤和水质的快速检测.

3 结 论

费式弧菌在测量过程中存活率高、稳定性好，本文采用费氏弧菌替代GB/T15441-1995中明亮发光菌T3小种测定油田添加剂的生物毒性，其测试结果在误差允许范围内，解决了明亮发光菌T3小种价格昂贵、市场供货不稳定等问题.与国标中的氯化汞相比，该测试方法选取的参比毒物ZnSO4·7H2O更加环保，且ZnSO4·7H2O浓度越大，发光强度越低，抑制率越高.费式弧菌检测方法可以有效检测丙烯酰胺单体的毒性，不仅可以评价油田添加剂的环保性能，还可推广应用于土壤和水质的快速检测，因此，可替代国标中的明亮发光菌T3小种，快速、便捷地进行生产现场的生物毒性测试.