长链非编码RNA尿路上皮癌胚抗原1/微RNA-143-3p/成纤维细胞生长因子1轴对胃癌细胞BGC-823增殖、迁移及侵袭的影响

段 聿，陈 吉，崔 宏，高美丽，赵翠娟，牛昊书，王 举

(1.内蒙古包钢医院消化内科，内蒙古 包头 014010；2.内蒙古自治区人民医院胃肠外科，内蒙古 呼和浩特 010017)

胃癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和病死率均较高[1]。虽然人们的饮食结构在不断调整，但胃癌的发病率仍呈升高趋势，给人们的生命健康造成严重威胁[2-3]。有研究表明，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可在表观遗传学、转录及翻译等多个层面实现基因表达的调控，从而在多种恶性肿瘤发生过程中发挥重要作用[4]。研究证实，lncRNA尿路上皮癌胚抗原1(urothelial carcinoma antigen 1，UCA1)在胆囊癌、膀胱癌等肿瘤中存在差异表达，且与患者预后密切相关，常作为癌症诊断和预后评估的标志物，可能为肿瘤治疗的潜在靶点[5-6]。目前关于lncRNA UCA1参与胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的具体机制仍不明确，需进一步探讨。本研究采用RNA干扰技术抑制胃癌细胞BGC-823中高表达的lncRNA UCA1基因，并观察lncRNA UCA1低表达对胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器胃癌细胞株BGC-823购自上海生命科学院细胞库；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自上海羽朵生物科技有限公司，lipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析试剂盒购自广州迈博生物科技有限公司，荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒购自德国QIAGEN公司，一步法反转录试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；DMI3000B型倒置荧光显微镜购自德国Leica公司，Step One Puls Real Time PCR仪购自美国ABI公司，800TS酶标仪购自美国Biotek公司，silncRNA UCA1(5′-ACGUGUACGGAACUGACGU-3′)、control-si序列(5′-CGUAUGGCUAGUGCUGAGC-3′)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养胃癌BGC-823细胞接种至含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃、含体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染及分组收集培养至对数生长期的BGC-823细胞，胰蛋白酶消化、重悬，以每孔3×104个接种至24孔板，并分为对照组、空载组和沉默组，每组5个复孔。继续于含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养24 h。将5 μL silncRNA UCA1(100 pmol)与 245 μL无血清不含双抗培养基混匀(A液)，将5 μL lipofectamineTM2000与 245 μL不含血清不含双抗培养基混匀(B液)，A、B液均静置5 min后混匀，静置20 min；沉默组：将A、B混合液加入细胞培养板，常温孵育30 min，37 ℃继续同条件培养48 h，于光镜下和倒置荧光显微镜下观察转染效率。空载组：用control-si代替silncRNA UCA1同法转染BGC-823细胞；对照组细胞不做处理。

1.2.3 细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)法检测细胞增殖能力收集稳定转染的BGC-823细胞及对照组细胞，调整细胞密度为3×107L-1，接种于96孔板，每孔100 μL，每组5个复孔，培养至24、48、72 h时，分别加入10 μL CCK-8溶液，培养4 h后弃去上层培养液，使用酶标仪于波长 450 nm处测定吸光度值。实验重复3次，取平均值。吸光度值越大，代表细胞增殖能力越强。

1.2.4 划痕实验检测细胞迁移能力收集稳定转染的BGC-823细胞及对照组细胞，调整细胞密度为3×107L-1，接种至6孔板，每孔2.5 mL，每组5个复孔，继续培养至细胞再次融合为单层细胞时，用50 μL无菌吸头于培养板中间划一直线，用细胞培养液轻轻吹洗直线边缘，保证边缘整齐，加入完全培养基继续培养24 h，倒置显微镜下观察并拍照，计算各组细胞迁移率。迁移率=(0 h划痕宽度-培养24 h后划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次，取平均值。

1.2.5 Transwell法检测细胞侵袭能力采用杯状结构的Transwell小室法检测稳定转染的BGC-823细胞及对照组细胞的侵袭能力。杯底滤膜由RPMI-1640培养基稀释的人工基质均匀涂布，37 ℃恒温培养箱放置30 min后干燥，在小室的下室加入无血清培养基培养24 h的BGC-823细胞上清液，上室加入BGC-823单细胞悬液，培养24 h后弃上清，镊子小心夹取滤膜，放入体积分数3.7%甲醇中固定，然后结晶紫染色，随机取5个视野，拍照并计数侵袭至滤膜背后的细胞数目。实验重复5次，取平均值。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法检测BGC-823细胞中lncRNA UCA1、微RNA(microRNA,miR)-143-3p、FGF1基因表达各组细胞贴壁生长至约为6孔培养板底面积的95%时，胰蛋白酶消化，收集细胞，TRIzol法提取细胞中总RNA，琼脂糖凝胶电泳法鉴定RNA样本完整性，反转录法获得互补链cDNA；根据SYBR PremixEX Taq试剂盒说明书进行RT-qPCR。引物序列：UCA1正向引物序列为5′-AGTCATGCTGTGACTGATGCG-3′，反向引物序列为5′-AAGTGCTGCCTGTGACCTGCG-3′；FGF1正向引物序列为5′-CGATGCTGTAGTGCTGATGTC-3′，反向引物序列为5′-GGTGATGTCCCGTGATGTCGT-3′；甘油醛-3-磷酸脱氨酶(glyceraldehyde-3-phosphote dehydrogenase,GAPDH)正向引物序列为5′-GTAGCTGTGCCAAGTGCCATG-3′，反向引物序列为5′-CCTGATGCTGGTAGTGATCGT-3′；miRNA-143-3p正向引物序列为5′-TAGTGCGTAGCTGATGCCTGC-3′，反向引物序列为5′-CTGATGCTGGTAGTCGAACTG-3′；U6正向引物序列为5′-ATGCTGATGCTGATGGCTGGA-3′，反向引物序列为5′-CCTAGAATGTGCGTGGATGAT-3′。反应体系：Taq酶11.0 μL，10.0 μmol·L-1上下游引物各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，双蒸水(double distilled water，ddH2O) 10.0 μL；反应条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性5 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，重复40个循环。以GAPDH和U6为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 转染效率调节激发光于绿光，暗视野下可见转入silncRNA UCA1或空载siRNA的BGC-823细胞发绿色荧光，未转入则无荧光(图1)，转染效率约为80%，可用于后续实验研究。

A：沉默组光镜下图片；B：沉默组倒置荧光显微镜下图片；C：空载组光镜下图片；D：空载组倒置荧光显微镜下图片。

2.2 3组细胞增殖能力比较结果见表1。培养24、48、72 h时，沉默组细胞的增殖能力显著低于对照组和空载组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组与空载组各时间点细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。3组细胞的增殖能力均随时间的延长而升高，各时间点之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组细胞增殖能力比较Tab.1 Comparison of proliferation ability of cells among the three groups

2.3 3组细胞迁移能力比较结果见图2。对照组、空载组及沉默组细胞迁移率分别为(71.44±6.19)%、(70.87±6.12)%、(42.31±5.18)%。沉默组细胞迁移率显著低于对照组和空载组，差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组与空载组细胞迁移率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A：对照组；B：空载组；C：沉默组。

2.4 3组细胞侵袭能力比较结果见图3。对照组、空载组和沉默组穿膜细胞数分别为(126.33±10.00)、(127.33±11.33)、(61.00±5.33)个。沉默组细胞穿膜细胞数显著低于对照组和空载组，差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组与空载组穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A：对照组；B：空载组；C：沉默组。

2.5 3组细胞中lncRNA UCA1、miR-143-3p、FGF1基因相对表达量比较结果见表2。沉默组细胞中lncRNA UCA1、FGF1基因相对表达量低于对照组和空载组，miR-143-3p基因相对表达量高于对照组和空载组，差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组与空载组细胞中lncRNA UCA1、miR-143-3p、FGF1基因相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 3组细胞lncRNA UCA1、miR-143-3p、FGF1基因相对表达量比较Tab.2 Comparison of relative expressions of lncRNA UCA1,miR-143-3p and FGF1 genes of cells among the three groups

3 讨论

近年来，随着分子生物学的不断发展，研究者发现，胃癌的发病原因除幽门螺杆菌感染、酗酒等因素外，还包括基因突变、基因驱动的转录组异常等[7-8]。有研究发现，在胃癌发生、发展的不同阶段，约140多种基因表达紊乱或基因表达产物发生变异[9]。lncRNA是一种不具有编码蛋白质功能的长度约200个核苷酸的RNA分子，lncRNA可通过多种途径参与调控恶性肿瘤的增殖、迁移及侵袭等生物学活动，如修饰组蛋白、重塑染色体、调控miRNA等，但具体调控机制仍不明确[10]。因此，探讨lncRNA对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的调控作用对临床上胃癌的治疗有重要价值。

UCA1属于竞争性内源RNA，在膀胱癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中呈异常高表达，可通过吸附miRNA间接调控靶基因表达，进而调控细胞周期、诱导上皮间质转化，提高癌细胞增殖、迁移及侵袭能力[11-12]。ZHAO等[13]研究表明，lncRNA UCA1在脑胶质瘤组织中表达量明显高于正常脑组织，且与肿瘤分级密切相关；体外实验还证实，lncRNA UCA1可通过上调细胞周期蛋白D1转录促进脑胶质瘤细胞增殖。蔡华荣等[14]研究表明，下调非小细胞肺癌A549细胞中lncRNA UCA1的表达可有效抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本研究结果显示，沉默胃癌细胞BGC-823中lncRNA UCA1表达后，其各时间点的增殖能力、细胞迁移率和穿膜细胞数均低于对照组和空载组，与ZHAO等[13]和蔡华荣等[14]研究结果一致，证实抑制lncRNA UCA1可显著抑制胃癌细胞BGC-823的增殖、迁移和侵袭能力。

研究表明，lncRNA拥有多种调控模式，某些lncRNA分子转录后可通过调控下游基因转录发挥信号传递作用，如lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，lncRNA可通过吸附miRNA调控下游靶基因，进而影响癌细胞增殖、迁移和侵袭等活动[15-16]。LUO等[17]研究表明，lncRNA UCA1可能通过调节miR-143及其下游高迁移率族蛋白B1调控膀胱癌细胞的侵袭能力。本研究结果显示，沉默组细胞中lncRNA UCA1、FGF1基因相对表达量低于对照组和空载组，miR-143-3p基因相对表达量高于对照组和空载组，提示lncRNA UCA1/miR-143-3p/FGF1轴可能是调控胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的重要机制，进一步证实lncRNA UCA1可能通过lncRNA-miRNA-mRNA调控网络影响癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

综上所述，lncRNA UCA1低表达可显著抑制胃癌细胞BGC-823的增殖、迁移和侵袭能力，可能通过调控lncRNA UCA1/miR-143-3p/FGF1轴发挥作用。在未来的研究中，需进一步探讨是否存在其他miRNA及下游mRNA参与调控胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。