肝纤维化大鼠肝郁病证结合模型的建立与评价

李鑫 王权 陈思源 张逢 余曦明

摘要：目的 通过构建肝纤维化大鼠肝郁病证结合的模型，为相关研究提供模型参考依据和临床治疗提供诊疗思路。方法 将30只SD大鼠随机分成2组，即空白组和模型组，每组15只。模型组大鼠每天定期皮下注射四氯化碳（carbon tetrachloride，CCL4）+ 橄榄油，自第5周起每日加用夹尾进行刺激，每次30min，3次/天;空白组大鼠每天定期皮下注射橄榄油，2组均连续给药8周。实验结束后记录动物和肝脏重量，收集肝脏组织制作石蜡切片染色后观察其病理变化，用ELISA法检测血清中AST和ALT相关活力指标。结果 （1）与空白组比较，模型组肝脏重量明显增加（P<0.05），血清中AST和ALT的活力显著升高（P<0.05或P<0.01）。（2）形态学结果显示：模型组大鼠肝脏出现了典型的肝纤维化病理改变，主要表现为肝组织内纤维结缔组织增生，脂肪空泡形成及相关炎性细胞浸润等。结论 采用此种方法造模可升高大鼠血清的AST和ALT活力，肝脏呈纤维化改变，成功建立了肝纤维化大鼠模型，是较为理想的造模方法。

关键词：肝纤维化;大鼠;模型;肝功能

中图分类号：R575 文献标志码：B 文章编号：1007-2349（2021）06-0066-04

【Abstract】Objective： To provide a model reference basis and clinical treatment ideas for related research by constructing a model combining liver depression and syndromes in rats with liver fibrosis. Methods： 30 SD rats were randomly divided into 2 groups， namely the blank group and the model group， 15 rats per group. The rats in the model group were given regular subcutaneous injections of carbon tetrachloride （CCL4） + olive oil every day， and starting from the 5th week， the tail clamp was added every day for stimulation， 30 minutes each time， 3 times a day. The rats in the blank group were given subcutaneous injection of olive oil every day. Both groups were given continuous administration for 8 weeks. After the experiment， the weight of the animals and liver was recorded. The liver tissues were collected to make paraffin sections and stained to observe the pathological changes. ELISA method was used to detect the AST and ALT related vitality indicators in the serum. Results： （1） Compared with that of the blank group， the liver weight of the model group was significantly increased （P<0.05）， and the activity of AST and ALT in the serum was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. （2） The morphological results showed that the liver of the model group showed typical pathological changes of liver fibrosis， which were mainly manifested as the hyperplasia of fibrous connective tissue in the liver tissue， the formation of fatty vacuoles and the infiltration of related inflammatory cells. Conclusion： Modeling with this method can increase the activity of AST and ALT in rat serum， and the liver shows fibrotic changes. The successful establishment of a rat model of liver fibrosis is an ideal method for modeling.

【Key words】Liver fibrosis; Rat; Model; Liver Function

肝纖维化（1iver fibrosis，LF）是对各种慢性肝脏损伤的一种代偿性反应，是“慢性肝炎-肝纤维化-肝硬化”发展的中心环节。目前，肝纤维化的形成被认为是一个动态的过程，涉及复杂的细胞和分子机制，导致组织修复机制的慢性激活。如果慢性损伤持续存在，炎症和纤维化可能发展成肝硬化，最终导致器官衰竭和死亡[1]。由此可见，肝纤维化是绝大多数慢性肝病的共同病理基础，同时也是多种慢性肝病向肝硬化发展的共同病理组织学基础。各种肝病多数经肝纤维化最后发展为晚期的肝硬化成为肝病死亡的主要原因。肝纤维化是严重威胁人类健康的疾病之一，但到目前为止，关于肝纤维化的治疗方面，暂无理想的治疗方法与治疗策略，抗肝纤维化治疗成了目前世界级医学难题。针对此种情况，笔者及所在团队设计通过采用大鼠皮下注射CCL4，并创新性的采用中医肝郁病症结合的干预方法，来构建能够模拟人体肝纤维化甚至肝硬化过程的大鼠肝纤维化动物模型。通过检测肝功能指标，HE和Masson染色来追踪肝纤维化的发病进程，为相关实验提供一种较为可靠的模型参考依据，同时对肝纤维化的早期诊断、药物干预治疗方面以及改善肝硬化病情和预后方面提供了良好的思路。

1 材料

1.1 实验动物 选用SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，140～160 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有公司，合格证号SCXK（湘）2016-0002，饲养在湖南中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室，许可证号SYXK（湘）2019-0009，环境温度20～26℃，湿度40%～60%，每天光照10h，自由饮水，喂以颗粒饲料。

1.2 药物及主要仪器 CCL4，500 mL，分析纯，由广东光华科技股份有限公司提供，批号：20181020;橄榄油由品渥食品有限公司提供;血清AST/ALT试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。

FA100L1电子天平：上海天平仪器总厂;TGL16型高速冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司;CElL-DYN3700型血液自动分析仪：美国 Avbbott.CO;KH2002半自动生化分析仪：济南金浩峰技术有限公司。

2 方法

2.1 动物分组 将30只大鼠适应性喂养2天后，按照随机数字表法分为2组：空白组和模型组，每组15只。

2.2 CCL4肝纤维化模型的建立 模型组：将CCL4与橄榄油按4∶6比例配成40%油剂，按0.3 mL/100 g剂量皮下注射，2次/周，持续8周;空白组：皮下注射橄榄油，2次/周，持续8周。

2.3 肝纤维化肝郁病证结合模型的建立 运用中医“怒伤肝”中医基础理论，模型组第5周开始加用慢性夹尾激怒造模：用止血钳夹住攻击鼠的尾巴，每次刺激30 min，3次/d，令其与其它大鼠撕打以激怒全笼大鼠，持续至第8周。

2.4 指标测定 给药8周后，戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠，取肝组织称重，计算肝脏指数（肝脏指数100%=肝脏湿重/末次体重×100%）。剪取各组相同部位组织置于4%的多聚甲醛进行固定，48h后脱水，石蜡包埋，切片厚度约5μm，烘片12h，肝组织病理变化采用HE染色观察肝组织炎症、细胞变性和肝纤维化情况，采用改良Masson染色判断肝组织纤维增生情况。腹主动脉采血，分离血清，ELISA法检测血清中肝功能指标ALT、AST的水平。

2.5 统计学方法 采用spss22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x2±s）表示。组间差异比较用单因素方差分析，方差齐性时，采用 LSD 方法进行组间多重比较;方差不齐时，采用 Dunnett's T3方法进行组间多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般状态 空白组大鼠毛色有光泽，饮食饮水正常，活动正常，体质量逐渐增加，生长发育状态良好且无死亡。模型组大鼠给药后状态逐渐转差，并且随着给药时间的延长，精神萎靡，饮水减少，食欲下降，活动减少，被毛蓬乱无光，体质量减轻，给药5周后开始出现个别死亡。

3.2 各组大鼠肝脏指数的水平比较 如表1所示：与空白组比较，模型组肝脏指数显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

3.3 各组大鼠血清肝功能指标活力的表达比较 大鼠的肝功能指标主要体现在AST和ALT活力的表达，如表2所示：与空白组比较，模型组的大鼠血清AST和ALT的活力水平均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

3.4 各组大鼠肝脏组织形态学的变化 肝组织HE染色显示：空白组肝脏肝小叶结构完整，界限清晰;中央静脉旁有放射状排列的肝细胞索;肝细胞呈多边形，边界清晰，胞浆丰富;汇管区结构清晰（图1）。模型组呈现出典型的肝纤维化表现，正常肝小叶结构破坏;肝细胞排列紊乱，有部分出现变性肿胀坏死;胞内有多量不规则的脂肪空泡形成，且中央静脉周围可见炎性细胞浸润，纤维结缔组织增生，甚至形成纤维间隔和假小叶（图2）。改良Masson染色显示：空白组肝小叶结构清楚，未见到明显肝纤维化表现（图3）。模型组可见肝组织内胶原纤维数量增多，有较多的纤维间隔形成（图4）。

4 讨论

中医学中并无肝纤维化的病名记载。根据其病症，基本当属于“胁痛”、“黄疸”、“鼓胀”等疾病范畴，而针对本病，中医药发挥多组分与多途径的结合作用，取得了较好的临床疗效。多种动物实验及药物临床试验均表明，中医药在关于慢性肝病及抗肝纤维化的临床疗效评价、作用机制与物质基础的研究等方面取得长足进步，并随之出现一批抗肝纤维化的中药新药，初步建立中西结合抗肝纤维化诊疗指南，显示中医药抗肝纤维化的治疗优势。但在肝纤维化动物模型方面仍沿用西医的造模方法，采用单因素造模，模型具备肝纤维化病理条件，而无中医证候特点，缺乏符合中醫基础理论具有特异性、可靠性、重复性的动物模型的造模方法。目前，国内外建立肝纤维化大鼠模型的方法多种多样，主要有以下几种方法：（1）腹腔注射二甲基亚硝胺（dimethylnitrosaine，DMN）法：此种方法造模时间短，仅需要四周，动物死亡率低，纤维化形成稳定，但DMN是致癌物，实验过程要特别注意个人防护[2]。（2）乙醇灌胃法：持续时间12周，模型简单易行，肝纤维化病变率高，能系统观察和研究酒精性肝病早期纤维化的动态变化，但缺点是造模时间长，会造成动物产生厌食[3]，消疲而死亡。（3）免疫造模法：主要是腹腔注射一种血清或蛋白（猪血清、血吸虫血清、人或牛血清白蛋白等），每周2次，连续8周。该模型特点是很少引起肝细胞损伤，稳定性好，符合肝纤维化形成的慢性过程，且与人类肝纤维化的形成原因类似，适合长期慢性肝炎的临床研究和免疫调控类药物的筛选研究[4]。但该方法不能反映人体慢性肝炎发病机制中病毒反复复制持续攻击人体的特点，与人肝纤维化的病理过程仍有很大差距。此外，该法模型复制时间长，动物致死率较高。（4）胆总管结扎法：该复制模型机制与人的继发性胆源性肝硬化机制相吻合，主要是通过造成肝外胆管阻塞，导致胆汁淤积，造成肝内血管受压，使肝细胞缺血、坏死。肝纤维增生延伸至胆管，包住肝小叶，引起肝纤维化。该法优点是操作简单，模型复制时间短，炎症反应轻，无毒，自发逆转程度低，稳定性良好[5]。但缺点是致死率高、结扎后大鼠性情暴躁、厌水厌食，不宜复制长期模型。

本实验创新性的根据五行理论，五志与五脏的对应关系，采用了“怒伤肝”的中医理论做为基础，并与西医现代肝纤维化造模方法结合，建立新的符合中医证候的肝郁且符合肝纤维化诊断标准的动物模型。实验结果表明，模型组的肝脏指数、AST和ALT的活力均比空白组有明显的升高，且肝脏组织病理特点与肝纤维化病理改变相似。我们认为，此种将肝纤维化疾病与中医证候相结合的方法是成功的，既能成功复制出与西医肝纤维化病理特征相一致，又能体现中医证候特点的病症结合动物模型，能够为临床诊疗提供良好的思路，值得进一步研究。

参考文献：

[1]刘叶红，陈娜，刘敏.P53与肝纤维化关系的研究进展[J].现代肿瘤医学，2013，21（4）：872-874.

[2]李生财，李彤.肝纤维化动物模型的造模原理及应用[J].中医药学刊，2006，24（12）：2267-2269.

[3]莫晓岚，夏国园，周德磊.肝纤维化动物模型构建的研究[J].现代医用影像学，2009，18（1）：43-45.

[4]王文萍，刘光炜，周语平.实验性肝纤维化造模方法研究[J].实用中医药杂志，2012，28（4）：267-268.

[5]Lohwasser C，Neureiter D，Popov Y，et al.Role of thereceptor for advanced glycation end products in hepaticfibrosis[J].World J Gastroentero，2009，15（46）：5789-5798.

（收稿日期：2021-01-13）