柳州地区传统发酵酸笋细菌多样性研究

陈正培，曹倩，蒋熠琤，周小玲，吴锦兰，崔娜，巩僖，熊建文

(柳州工学院 食品与化学工程系，广西 柳州 545616)

酸笋属于典型的发酵食品，传统工艺将新鲜竹笋切块、洗净后加入老坛酸水中进行发酵[1-2]。随着柳州螺蛳粉产业的发展，酸笋的市场需求量也迅速增大，逐渐从家庭作坊小规模制作走向工厂大规模生产，而新工艺生产的酸笋口感较传统工艺的差，但传统工艺又不能满足大规模生产的需求，这是当前酸笋行业发展急需解决的问题。作为发酵食品，微生物对其风味的形成至关重要，因此了解传统酸笋中的微生物群落结构，可为酸笋规模化生产提供参考，优化酸笋发酵的微生物体系，是开发高品质酸笋的重要途径。

高通量测序是近年来兴起的用于食品微生物多样性分析的前沿技术，应用非常广泛[3-6]。崔梦君等[7]采用高通量测序技术分析农家酱中的微生物群落，发现主要的细菌属有乳酸杆菌属、棒状杆菌、芽孢杆菌属和葡萄球菌属等。安飞宇等[8]利用宏转录组学技术对豆酱自然发酵过程中的活性菌群及风味物质的关联分析表明嗜盐四联球菌、植物乳杆菌、酸鱼乳杆菌、蛋白原酶乳杆菌、枯草芽孢杆菌及粪肠球菌与风味物质呈显著正相关，故将其定义为对风味物质合成有重要影响的核心发酵微生物种。该技术无需对微生物进行培养，分析结果覆盖了样品中的未培养微生物。基于 Illumina HiSeq 2500测序平台可对样品中的微生物进行物种多样性、物种丰度分析以及功能基因预测，是分析发酵食品中微生物群落结构的有力工具。本研究利用该技术对酸笋发酵液中的细菌多样性进行了分析，旨在为开发适用于大规模生产的新工艺奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸笋发酵液分别来自柳州的柳北区、柳城县和鹿寨县，每个地区各采集6份来自不同家庭的酸笋发酵液，装入无菌瓶后于低温(冰盒)条件下运回实验室，将各地区的样品随机分为2组，每组3个样品，并进行等体积混合，得到6个混合样品，分别为LC1(来自柳城县)、LC2(来自柳城县)、LB1(来自柳北区)、LB2(来自柳北区)、LZ1(来自鹿寨县)、LZ2(来自鹿寨县)。

细菌基因组DNA提取试剂盒：美国Omega科技公司。

1.2 仪器与设备

5425高速离心机 德国 Eppendorf公司；水平电泳仪 北京六一生物科技有限公司；Master-S15超纯水机 上海和泰仪器有限公司；GenoSens1880凝胶成像分析系统 上海勤翔科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

分别取以上6个混合酸笋发酵液20 mL，12000 r/min离心1 min，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，参考Omega Bacterial DNA Kit 说明书提取细菌的总DNA，经过浓度测定后，将细菌总DNA于-80 ℃超低温冰箱中临时保存，取一定量的总DNA送至测序公司进行高通量测序。

1.3.2 高通量测序1.3.2.1 DNA浓度的检测

用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA 浓度和纯度。

1.3.2.2 PCR扩增及测序

细菌多样性分析采用16S rDNA基因可变区(V3～V4)区域通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[9-10]，PCR扩增程序：①95 ℃预变性3 min；②95 ℃变性30 s；③退火温度下退火15 s；④72 ℃延长30 s；⑤72 ℃延长10 min；②～④循环30次。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，利用AMPure XT beads 试剂盒对目标片段进行回收纯化，构建测序文库，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。

1.3.2.3 数据分析

利用FLASH软件，通过Overlap对样品的Reads进行拼接，得到Raw Tags数据；利用Trimmomatic软件对Raw Tags进行过滤[11]，得到高质量的Clean Tags；利用Uchime软件鉴定并去除嵌合体序列，得到Effective Tags；使用QIIME(Version 1.8.0)软件中的 Uclust[12]对Tags在97%的相似度水平下进行聚类，获得OTU，并基于Silva细菌分类学数据库对OTU进行分类学注释。利用Uclust 软件对OTU 进行聚类分析，并选择OTU 数目变化与Uclust 参数之间最佳近似值。并对物种丰度进行分析，同时根据NCBI提供的已有微生物物种的分类学数据库，使用Megan软件将测序得到的物种丰度信息回归至数据库的分类学系统关系树中[13]。采用主坐标分析法(principal coordinates analysis，PCoA)分析各样品主因子。利用Metastats软件对组间的物种丰度数据进行T检验；得到p值，了解组间主要的差异物种。最后使用PICRUSt软件通过比对16S测序数据获得的物种组成信息，推测样本中的功能基因组成，从而分析不同样本或分组之间在功能上的差异。

2 结果分析

2.1 各地区样品中的OTU数分布

通过对细菌16S rDNA进行基因测序，结果见图1，6个测序样品共获得480，136对Reads，双端Reads拼接、过滤后共产生344216条Clean Tags，其中柳北区样品产生128617条Clean Tags，柳城县样品产生105335条Clean Tags，鹿寨县样品产生110261条Clean Tags。所有序列均按97%相似度归为OTU，共聚合了191个OTU，柳北区样品的OTU数显著低于鹿寨县和柳城县样品的OTU数，鹿寨县和柳城县样品OTU数无显著差异。分析不同地区样品间的共有物种和特有物种数，结果见图2。3个地区共有的OTU为48个，柳北区特有的OTU占比6.5%，鹿寨县特有的OTU占比1.0%，柳城县特有的OTU占比1.1%。

图1 不同地区样品的OTU数分布图Fig.1 OTU number distribution diagram of samples from different regions

图2 不同地区样品的Venn图Fig.2 Venn diagram of samples from different regions

2.2 各地区酸笋样品中的物种分布

在属水平上分析鹿寨、县柳北区和柳城县酸笋中的细菌物种丰度，筛选丰度大于0.1%的物种，结果见表1。在3个地区样品中丰度大于0.1%的属共有16个，分别为乳杆菌属、气斯卡多维亚氏菌属、不动杆菌属、泛菌属、拟杆菌属、拟普雷沃菌属、志贺氏菌属、艾克曼菌属、瘤胃梭菌属、嗜胆菌属、普雷沃氏菌属、阿里叶柄菌属、罗斯氏菌属、梭状芽孢杆菌属、瘤胃球菌属、弓(形)杆菌属、葡萄球菌属。其中乳杆菌属占比最大，在3个地区的样品中丰度均超过了90%，是柳州酸笋中的主要优势菌，其中柳北地区样品的含量最高，达到96.11%。在柳北地区的酸笋样品中，满足丰度大于0.1%的物种只有5种，鹿寨地区有8种，柳城地区有10种，柳城与鹿寨的物种分布更为相似。

表1 柳州地区酸笋物种丰度Table 1 The species abundance of sour bamboo shoots in Liuzhou area %

续 表

2.3 Mega分类树分析

根据NCBI提供的已有微生物物种的分类学数据库，使用Megan软件将测序得到的物种丰度信息回归至数据库的分类学系统关系树中，结果见图3。来自柳城、鹿寨和柳北3个地区的酸笋样品中原核微生物主要分布在9个门、13个纲、23个目、36个科和75个属。在科水平上，主要分布在乳杆菌科、毛螺菌科和瘤胃菌科中。

图3 酸笋样品的Mega分类树Fig.3 Mega taxonomic tree of sour bamboo shoot samples

2.4 主成分分析

在属水平上对来自柳北、柳城和鹿寨的6个样品进行主成分分析，经过提取因子后，PCoA-PC1占比为86.85%，PCoA-PC2占比8.45%。分析各样品在两个主成分上的差异，结果见图4。各地区样品组内在PC1上均保持一致，除柳北的样品外，来自柳城和鹿寨的各样品在PCoA-PC2上有明显的差异。导致这种结果的原因可能是酸笋发酵的主要物种只有乳杆菌属，其他物种并不是酸笋发酵的关键菌种，因此其在不同样品中的丰度有较大的差异。

图4 属水平上的PCoA分析Fig.4 PCoA analysis at the genus level

2.5 组间显著性差异分析

利用Metastats对柳北、柳城和鹿寨的样品进行两两比较，分析属水平上导致组间差异的微生物，结果见表2。在属水平上鹿寨与柳北的酸笋样品中原核微生物的种类非常相似，只有梭杆菌属(Fusobacterium)有显著差异。柳城的酸笋样品与柳北和鹿寨的样品差异较大，主要体现在梭状芽孢杆菌(Clostridium)、甘蓝油菜菌属(Brassicanapus)、普氏菌属(Prevotella)、 泛菌属(Pantoea)4个属上。

表2 地区间有显著差异的菌株Table 2 Significantly different strains from different regions

2.6 组间功能基因的差异性分析

使用PICRUSt软件通过比对16S测序数据获得的物种组成信息，推测样本中的功能基因组成，结果见图5。通过KEGG代谢途径的差异分析，观测不同分组的样品之间微生物群落的功能基因在代谢途径上的差异和变化，结果各组之间均无显著性差异。3组样品中共发现了39种功能基因，其中糖类代谢基因的丰度约为15%～18%，氨基酸代谢基因丰度为7%～12%、酯类代谢基因丰度约为3%～5%。

图5 酸笋发酵液中的功能基因分析Fig.5 Functional genes infermentation broth of sour bamboo shoots

3 结论

本研究以柳州3个地区的传统发酵酸笋为研究对象，采用 Illumina MiSeq 2500高通量测序技术分析样品中细菌菌群组成情况。结果表明，不同地区酸笋样品在物种多样性上有一定的差异，柳北的样品与鹿寨的样品细菌群落结构更为相似，但与柳城的样品存在较大差异，值得进一步研究。酸笋中存在的优势菌为乳杆菌属，其丰度达到90%以上，与其他发酵食品相似，刘怡萱等[14]发现乳杆菌属作为优势菌存在于西藏农牧区牦牛酸奶中，孙慧君等[15]发现其作为优势菌存在于锦州地区传统发酵小菜中。毛螺菌属和瘤胃菌属也较为丰富，瘤胃菌属可以发酵纤维素和纤维二糖，可能是使酸笋变软的主要种群，同时也可以产生乙酸、甲酸等有机酸，所有样品中均有志贺氏菌和葡萄球菌的存在，丰度较低，并不会引起人的疾病，但也应引起人们的注意，可能存在一定安全风险。经过功能基因分析，糖代谢的基因丰度最大，达到15%～18%，可能是微生物能适应在低可溶性糖环境下发酵的原因，氨基酸代谢相关的基因丰度达到7%～12%，它在赋予酸笋鲜味上起了重要作用。该技术在广西酸笋细菌多样性分析中的应用，较为全面地解析了广西酸笋中的细菌群落结构，为今后开发复合发酵菌剂、优化酸笋发酵体系提供了理论依据。