酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能和盲肠菌群的影响

2021-08-09金瑶瑶王琳燚孙全友席燕燕袁艳枝王改利李绍钰

动物营养学报 2021年7期

金瑶瑶徐彬王琳燚孙全友席燕燕袁艳枝王改利付趁李绍钰*

(1.河南农业大学动物科技学院，郑州 450002；2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002)

饲料全面禁抗对肉仔鸡生长速度和肠道健康造成挑战，因此寻找一种绿色安全的饲料添加剂来代替抗生素成为大势所趋。青蒿为一年生草本植物，其被广泛种植于世界各地。青蒿中的主要有效成分为倍半萜类、氨基酸、多酚以及黄酮类等，这些有效成分使得青蒿具有抗菌、抗炎及抗疟疾等作用[1-2]。然而，植物细胞壁的存在使得青蒿中有效成分的释放存在阻碍，而使用纤维素酶和果胶酶处理，可以促进植物中有效成分的释放[3]。研究发现，在热应激肉仔鸡饲粮中添加酶处理的青蒿，可以提高肉仔鸡采食量，增强其抗氧化能力，缓解热应激对肉仔鸡造成的损伤[4]；在肉仔鸡饲粮中添加青蒿粉和青蒿精油，可在一定程度上减少肉仔鸡盲肠中肠杆菌科细菌的数量，并使乳酸菌数量得到相应地增加[5]。地衣芽孢杆菌为兼氧革兰氏阳性菌，具有较强的抗逆性，在肠道中可通过与有害菌竞争定植位点，促进有益菌定植，起到改善肠道健康的作用。在肉仔鸡饲粮中添加地衣芽孢杆菌，可显著提升平均日增重，降低盲肠中致病菌的数量，显著提高乳杆菌属的丰度，改善肠道内环境[6]。目前，酶解青蒿对肉仔鸡的影响主要集中于生长性能，其对肠道菌群方面的影响报道较少，并且酶解青蒿与地衣芽孢杆菌联合应用对生长性能以及肠道菌群的影响更是鲜有报道。因此，本试验通过在肉仔鸡饲粮中单独添加酶解青蒿或与地衣芽孢杆菌联用，利用高通量测序技术探讨其对肉仔鸡肠道菌群的影响，进而观察对生长性能的作用，以期为酶解青蒿在肉仔鸡生产中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青蒿产于重庆，收割于生长盛期至花蕾期，使用纤维素酶和果胶酶对其进行处理，酶解青蒿主要活性成分为青蒿素、多酚和黄酮类化合物。抗生素主要成分为维吉尼霉素，含量为50%。地衣芽孢杆菌活菌总数量为2×1010CFU/g。

1.2 试验设计

选用初始体重相近的1日龄科宝(Cobb)肉仔鸡480只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复20只。对照组饲喂基础饲粮，抗生素组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组分别饲喂在基础饲粮中添加20 mg/kg抗生素、1 g/kg酶解青蒿以及1 g/kg酶解青蒿+200 mg/kg地衣芽孢杆菌的饲粮。基础饲粮参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 33—2004《鸡饲养标准》进行配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3 饲养管理

饲养试验在河南大用实业有限公司进行，采用3层笼养，每笼饲养20只鸡，试验期42 d。试验期间鸡只自由采食和饮水；试验第1周温度保持在32～34 ℃，然后每周逐渐降低2～3 ℃，直至降为23 ℃并保持不变；按常规免疫程序进行接种。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能的测定

在42日龄，以重复为单位对试验鸡进行称重，称重前肉鸡禁食12 h，同时详细记录试验期间各重复耗料量，计算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.4.2 盲肠菌群的测定

在42日龄，每组随机选取3只接近平均体重的肉仔鸡进行屠宰，收集盲肠内容物于无菌冻存管中，置于液氮中保存，用于菌群测定。

用FastDNA Spin Kit for Soil(MP公司，美国)试剂盒对盲肠内容物进行DNA抽提，用Nanodrop 2000对DNA浓度和纯度进行检测，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测进行DNA提取质量。

1.5 数据处理与分析

生长性能数据采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若差异显著，则用Duncan氏法进行多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准，结果以平均值±标准差表示。

盲肠菌群原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，FLASH软件进行拼接。对优化后的序列根据97%的相似度进行操作分类单元(OTU)聚类，并且对每个样本在各个水平的菌群组成进行统计。试验结果在I-Sanger云平台进行分析。

2 结果与分析

2.1 酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能的影响

由表2可知，与对照组相比，试验Ⅱ组肉仔鸡平均日增重和42日龄终末体重显著提高(P<0.05)，抗生素组和试验Ⅰ组上述指标有提高趋势，但差异不显著(P>0.05)。各组之间肉仔鸡平均日采食量和料重比无显著差异(P>0.05)。

表2 酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能的影响

2.2 酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对肉仔鸡盲肠菌群的影响

2.2.1 序列及OTU统计

本次试验采用高通量测序的方法对各组肉仔鸡盲肠菌群进行了测序分析，最终获得667 924条有效序列，平均长度414.61 bp。对获得的有效序列按照97%相似性进行OTU聚类分析，得到所有样本平均聚类的OTU数目为828。同时，采用随机抽样的方法，从获得的样本中随机抽取一定数量的序列，进行稀释曲线的绘制，得到图1。在该曲线中，当测序量达到一定的深度，则曲线趋于平坦，由此可得出本次测序样本深度充分，数据量合理。

2.2.2 alpha多样性分析

由表3可知，各组肉仔鸡盲肠菌群测序覆盖度达到99.77%以上。抗生素组和各试验组肉仔鸡盲肠菌群Ace指数和Chao1指数与对照组相比均有提高的趋势，但差异不显著(P>0.05)；抗生素组和各试验组肉仔鸡盲肠菌群Shannon指数显著高于对照组(P<0.05)，且Simpson指数显著低于对照组(P<0.05)。这说明在肉仔鸡饲粮中添加酶解青蒿和地衣芽孢杆菌有助于提高肉仔鸡盲肠菌群丰富度和多样性。

表3 酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对肉仔鸡盲肠菌群多样性的影响

2.2.3 beta多样性分析

图2为各组肉仔鸡盲肠菌群组成的主坐标分析(PCoA)图。结果显示，抗生素组和各试验组在主效应1(PC1)上与对照组有较为明显的组间区分，说明抗生素组和试验组的菌群组成更为相似。

图2 PCoA图

2.2.4 盲肠菌群组成

从门水平分析，各组肉仔鸡盲肠菌群组成见图3和表4。由图3可知，各组肉仔鸡盲肠菌群中，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和软壁菌门(Tenericutes)为优势菌门，其总的相对丰度占96.7%～99.2%。由表4可知，与对照组相比，抗生素组和各试验组肉仔鸡盲肠菌群中厚壁菌门相对丰度显著提高(P<0.05)，软壁菌门相对丰度有降低趋势，但差异不显著(P>0.05)；与对照组相比，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组肉仔鸡盲肠菌群中拟杆菌门相对丰度显著降低(P<0.05)。上述结果说明，在饲粮中添加酶解青蒿和地衣芽孢杆菌改变了肉仔鸡盲肠在门水平上的菌群组成。

Firmicutes：厚壁菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Tenericutes：软壁菌门；Proteobacteria：变形菌门；Cyanobacteria：蓝藻菌门；Others：其他。

表4 肉仔鸡盲肠优势菌群在门水平上的相对丰度

从属水平分析，各组肉仔鸡盲肠菌群组成见图4和表5。由图4可知，各组肉仔鸡盲肠菌群中菌属的相对丰度不同，其中相对丰度大于2%的菌属有19种。对照组相对丰度较高的菌属为拟杆菌属(Bacteroides，58.11%)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium，10.23%)和另枝菌属(Alistipes，6.92%)，抗生素组相对丰度较高的菌属为拟杆菌属(20.45%)、另枝菌属(8.02%)和粪杆菌属(Faecalibacterium，7.37%)，试验Ⅰ组相对丰度较高的菌属为粪杆菌属(15.46%)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella，9.20%)和未明确梭菌科相关菌属(norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group，7.98%)，试验Ⅱ组相对丰度较高的菌属为粪杆菌属(15.11%)、瘤胃球菌科UCG-014菌属(Ruminococcaceae_UCG-014，13.57%)、拟杆菌属(11.99%)。由表5可知，与对照组相比，抗生素组和各试验组肉仔鸡盲肠菌群中拟杆菌属相对丰度显著降低(P<0.05)，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组粪杆菌属相对丰度显著提高(P<0.05)，抗生素组、试验Ⅰ组瘤胃球菌科UCG-014菌属相对丰度有提高趋势，但差异不显著(P>0.05)，试验Ⅱ组瘤胃球菌科UCG-014菌属相对丰度显著提高(P<0.05)，试验Ⅰ组未明确梭菌科相关菌属相对丰度显著提高(P<0.05)，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组考拉杆菌属相对丰度显著降低(P<0.05)。

Bacteroides:拟杆菌属；Faecalibacterium:粪杆菌属；Alistipes:另枝菌属；Ruminococcaceae_UCG-014:瘤胃球菌科UCG-014菌属；norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group:未明确梭菌科相关菌属；Phascolarctobacterium:考拉杆菌属；unclassified_f_Ruminococcaceae:未分类的瘤胃球菌科菌属；Barnesiella:巴恩斯氏菌属；[Ruminococcus]_torques_group:瘤胃球菌属扭链群；Parabacteroides:副杆状菌属；unclassified_f_Lachnospiraceae:未分类毛螺旋菌科相关菌属；norank_f_norank_o_Mollicutes_RF39:norank_f_norank_o_柔膜菌纲RF39菌属；[Eubacterium]_coprostanoligenes_group:产粪甾醇真细菌群菌属；Butyricicoccus:丁酸球菌属；Ruminococcaceae_UCG-005:瘤胃球菌科UCG-005菌属；Rikenella:理研菌属；norank_f_Flavobacteriaceae:未明确黄杆菌科菌属；Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕菌科R-7群菌属；Ruminococcus 1:瘤胃球菌属1；Others:其他。

表5 肉仔鸡盲肠优势菌群在属水平上的相对丰度

3 讨论

3.1 酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能的影响

青蒿具有抗球虫、抗氧化、改善肠道黏膜形态和提高肠道消化酶等作用，从而为肉仔鸡的健康生长提供保障。酶解青蒿是由纤维素酶和果胶酶对青蒿进行处理得到的，经过酶处理可以使青蒿中有效成分得到更高效地释放。地衣芽孢杆菌为兼性厌氧菌，在肠道内定植后可迅速消耗掉肠道中的游离氧，为肠道中的有益菌提供适宜生长的环境，并且其本身在肠道中定植后还可产生许多淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等消化酶[7]，此外，地衣芽孢杆菌也能刺激肠道免疫细胞的生长，从而提高肠道对致病菌的抑制作用[8]。热应激条件下，肉仔鸡饲粮中添加0.005%青蒿油和1%青蒿粉混合物，可显著提高肉仔鸡平均日采食量，减少大肠杆菌以及葡萄球菌的数量，增加乳酸杆菌的数量[9]；加入酶解青蒿，可提高热应激状态下肉仔鸡空肠中脂肪酶、胰蛋白酶的活性，提高空肠绒毛高度与绒隐比(绒毛高度/隐窝深度)，改善热应激状态下肉仔鸡的肠道形态[10]。而在肉鸡饲粮中单独添加地衣芽孢杆菌时，发现其不仅能提高坏死性肠炎肉仔鸡生长性能，并且可以调节坏死性肠炎所带来的肠道菌群的改变[11]。本试验中，饲粮添加抗生素和单独添加酶解青蒿有提高肉仔鸡平均日增重和终末体重的趋势，酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌添加则显著提高肉仔鸡1～42日龄平均日增重和终末体重。抗生素维吉尼霉素可能通过抑制革兰氏阳性有害菌，延长饲粮在肠道中的停留时间，从而提高营养物质的吸收[12]。本试验单独添加酶解青蒿对肉仔鸡生长性能的影响与Wan等[13]的研究结果相似，酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对生长性能的影响优于单独添加酶解青蒿，初步推测其可能原因一方面是酶解青蒿改善了肠道形态，扩大了小肠对营养物质消化吸收表面积，并且其活性成分抑制了肠道中的有害菌；另一方面是地衣芽孢杆菌在肠道内定植后可产生有利于消化的酶和短链脂肪酸，从而提高饲粮的消化吸收率，并且促进有益菌群的增殖。因此，本试验结果表明，饲粮单独添加酶解青蒿或与地衣芽孢杆菌联用对肉仔鸡生长性能的改善效果不亚于抗生素。

3.2 酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对肉仔鸡盲肠菌群多样性和丰富度的影响

肠道是动物机体重要的消化器官，也是机体中最大的细菌库，肠道的生物屏障主要由肠道中的菌群构成，菌群的数量和结构对宿主的消化和健康起到重要的作用[14]。肠道菌群分析中，Ace指数和Chao1指数越大反映肠道菌群的丰富度越高，Shannon指数越大、Simpson指数越小则反映肠道菌群的多样性越高，且肠道菌群多样性通常与菌群的稳定性和抵抗致病菌感染的能力呈正相关[15]。余怡然[16]研究表明，给MRL/lpr小鼠灌胃0.24 g/mL青蒿水剂，与模型小鼠相比，青蒿组小鼠肠道菌群Shannon指数和Simpson指数显著提高，表明灌胃青蒿水剂可以提高试验小鼠肠道菌群多样性和丰富度。袁慧坤[17]研究表明，在北京鸭的饲粮中添加地衣芽孢杆菌，可使北京鸭肠道菌群多样性得到提高，与对照组相比，地衣芽孢杆菌添加组肠道菌群Chao1指数和Shannon指数均有增加的趋势。在本试验中，抗生素组和各试验组肉仔鸡盲肠菌群Shannon指数显著高于对照组，并且Simpson指数显著低于对照组，表明抗生素组和试验组的肠道菌群多样性高于对照组；同时，对照组的Ace指数和Chao1指数也低于抗生素组和试验组，表明抗生素组和试验组肠道菌群丰富度高于对照组。引起试验Ⅰ组、试验Ⅱ组肉仔鸡肠道菌群多样性和丰富度提高的原因，可能是由于饲粮中加入的酶解青蒿中的有效活性成分如多酚、黄酮等物质具有提高肠道菌群数量以及调节菌群多样性等作用[18]；同时，地衣芽孢杆菌可通过消耗肠道游离氧促进厌氧有益菌增殖，从而提高肠道菌群多样性和丰富度，进而起到改善肠道微生态平衡的作用[19]。因此，本试验结果说明，饲粮单独添加酶解青蒿或与地衣芽孢杆菌联用均可提高肉仔鸡肠道菌群的多样性和丰富度。

3.3 酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对肉仔鸡盲肠菌群组间差异的影响

由PCoA图可知，各组肠道菌群具有不同的肠道区系，但是抗生素组和试验组肠道菌群组间差异较小。从本试验的肠道菌群组成以及组间差异分析可知，饲粮单独添加酶解青蒿或与地衣芽孢杆菌联用增加了肉仔鸡肠道菌群中分解纤维素以及产生丁酸等有益菌的数量，使肠道菌群向有益健康的方向发展，从而促进肉仔鸡的生长。酶解青蒿主要是通过其活性成分中的青蒿素抑制革兰氏阴性菌如大肠杆菌的蛋白质合成、破坏细菌细胞壁以及干扰细菌药物外排基因表达来达到抑菌效果[20]。地衣芽孢杆菌则主要是通过生物夺氧使肠道达到厌氧环境，促进有益菌的生长。维吉尼霉素主要作用于革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌的核糖体，从而阻止细菌蛋白质的合成，并且由于其不能通过革兰氏阴性菌的细胞膜，所以其对革兰氏阴性菌没有影响[21]。因此，本试验在饲粮中添加抗生素、酶解青蒿以及酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌会对肉仔鸡肠道菌群区系产生不同的影响，但都是抑制了不同种属的有害菌，使肠道菌群往健康方向发展。

3.4 酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌对肉仔鸡盲肠菌群组成的影响

研究表明，在门水平上，肠道菌群主要由厚壁菌门(35%～80%)和拟杆菌门(17%～60%)组成[22]。当肠道中的厚壁菌门相对丰度得到提升时，有利于机体吸收食物中的热量[23]，厚壁菌门相对丰度的提高还可以促进微生物菌群对纤维素的分解[24]，并且其产生的短链脂肪酸有利于维持机体肠道健康[25]。张亚楠等[26]对不同产蛋水平的蛋鸡肠道菌群进行分析表明，在门水平上，不论产蛋量高或产蛋量低的组，4种优势菌门均为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门，而且厚壁菌门的相对丰度在所有组别中占绝对优势地位。在本试验中，厚壁菌门和拟杆菌门为各组的优势菌门，并且与对照组相比，抗生素组和各试验组厚壁菌门相对丰度显著提高，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组拟杆菌门相对丰度显著降低，这表明添加抗生素、酶解青蒿以及酶解青蒿联合地衣芽孢杆菌改变了肉仔鸡肠道菌群结构。Turnbaugh等[27]研究发现，体型较为瘦小的小鼠其肠道中的拟杆菌门相对丰度相对较高，而肠道中富集厚壁菌门的小鼠则较肥胖。由此提示本研究中试验组肉仔鸡生长性能的提高可能是通过调整厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度的比例而实现的。

本试验中，在属水平上，对照组和抗生素组的优势菌属为拟杆菌属，该属细菌能帮助宿主分解多糖，并且可以产生丁酸盐，从而提高宿主免疫力，有利于调节肠道免疫系统[28-29]；试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的优势菌属为粪杆菌属和瘤胃球菌科UCG-014菌属，该类菌属被认为是肠道健康象征标志的最重要菌群之一，其可以分泌抗炎物质(水杨酸)和抗炎分子，协助抵御外来入侵病菌，同时可以减轻肠道炎症保护肠道健康[30-31]，同时该菌属也能够产生丁酸，而丁酸又可以有效地促进鸡空肠、盲肠防御素9、防御素14和放线菌素B1基因的变达，抑制异原微生物如沙门氏菌的侵袭[32]。在本试验中，饲粮添加抗生素降低了肉仔鸡盲肠中有害菌属的相对丰度，提高了肠道的免疫能力，并且其优势菌属拟杆菌属能够促进营养物质的消化吸收，进而提高生长性能。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组单独添加酶解青蒿或与地衣芽孢杆菌联用均对肉仔鸡盲肠中粪杆菌属和瘤胃球菌科UCG-014菌属相对丰度具有提升作用，且联合作用对瘤胃球菌科UCG-014菌属相对丰度的提升效果更好，其原因可能是酶解青蒿中的有效活性成分青蒿素、多酚类物质降低了拟杆菌属的相对丰度，并且为粪杆菌属和瘤胃球菌科UCG-014菌属等菌属提供了底物，从而促进其在肠道中的生长繁殖[33]。在试验Ⅱ组中，酶解青蒿和地衣芽孢杆菌联合添加对瘤胃球菌科UCG-014菌属的增殖产生协同效应，其一方面原因可能是地衣芽孢杆菌在肠道内定植后消耗活性氧，并通过分泌活性物质抑制有害菌群，促进有益菌增殖；另一方面可能为酶解青蒿的加入为瘤胃球菌科UCG-014菌属提供了底物，加强了其在肠道内的增殖效果。此外，增殖后的这些有益菌属又可促进肠道中葡萄糖的代谢以及纤维的吸收，从而提高肉仔鸡体重。

因此，本研究结果说明，单独添加酶解青蒿或与地衣芽孢杆菌联用能使肠道中厚壁菌门、粪杆菌属和瘤胃球菌科UCG-014菌属相对丰度显著提高，这些菌群的增加有助于机体对营养物质的吸收，有利于维持肠道健康，从而提高肉仔鸡生长性能。