华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的克隆及表达*

康晓彤 陈 辉

(华南农业大学林学与风景园林学院 广州 510642)

华山松(Pinusarmandi)是中国特有的针叶树种，在秦巴林区的森林生态系统中起着十分重要的作用，但秦巴林区的华山松长期遭受华山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)的危害，导致大量华山松死亡(Chenetal.,2006)。华山松大小蠹主要危害30年以上的华山松，造成寄主树木迅速衰弱，后期引发多种次期性小蠹联合入侵(Chenetal.,2007;2010)。华山松大小蠹所携带的蓝变真菌秦岭细粘束孢(Leptographiumqinlingensis)在华山松大小蠹入侵之时就开始破坏华山松树脂分泌系统，分解寄主树木木质部树脂道泌脂细胞，随着菌丝在寄主树木树脂道内大量繁殖，树木的薄壁细胞被分解，在华山松大小蠹的协同作用下，导致寄主树木的迅速死亡(唐明等，1999)。

萜类化合物(Terpenoids)是针叶树树脂的主要成分，由单萜类(C10)、倍半萜类(C15)和二萜类(C20)化合物组成，寄主植物分泌的萜类化合物不仅可以作为趋避剂或毒素对抗植食性昆虫和致病菌，还可以作为昆虫识别寄主植物的主要途径或寄主植物的引诱剂(Bohlmannetal.,1999;Phillipsetal.,1999;Trappetal.,2001;Martinetal.,2002；2003)。针叶树释放的单萜类挥发物可作为小蠹虫的寄主识别信号，小蠹虫入侵寄主树木可诱导寄主挥发性物质变化，进而吸引天敌(Hilkeretal.,2002;Mummetal.,2003)。霍燕等(2010)研究发现不同被害阶段华山松韧皮部释放的单萜类挥发物中α-蒎烯相对含量最高，柠檬烯含量则呈增加趋势。北美云杉(Piceasitchensis)在受到象甲危害后，alpha-pinene synthase基因开始上调，木质部树脂道α-蒎烯含量也随之升高；用钻孔的方式模拟象甲取食，发现(-)-limonene synthase基因转录水平升高，柠檬烯含量也相应增加(Byun-McKayetal.,2003,2006)。大量研究表明alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因是松科植物与防御相关重要的单萜合酶基因，且萜类化合物合成与代谢受萜类合酶(terpene synthases，TPS)基因调控(Byun-McKayetal.,2003；2006;Keelingetal.,2011;Chenetal.,2019)。目前松科(Pinaceae)植物关于TPS的研究主要集中于大冷杉(Abiesgrandis)、挪威云杉(Piceaabies)和北美云杉，火炬松(Pinustaeda)、海岸松(Pinuspinaster)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、马尾松(Pinusmassoniana)也有部分研究报道。

在针叶树木萜类化合物生化和分子防御研究中通常采用机械性创伤(Gijzenetal.,1992;Bohlmannetal.,1997;Steeleetal.,1998)或茉莉酸甲酯(MeJA)处理模拟昆虫的入侵危害(Richardetal.,2000;Martinetal.,2002；2003;Fäldtetal.,2003)。大量研究表明MeJA引起的创伤性树脂与针叶树木受到昆虫和病原体入侵的反应非常相似(Croiséetal.,1993;Franceschietal.,2002;Martinetal.,2002)。

华山松大小蠹主要危害30年以上健康华山松(李臻等，2009)，华山松大小蠹成虫入侵寄主华山松后，在蓝变真菌的协调作用下，产生抵御寄主华山松萜烯类化合物等生理生化抗性(唐明等，1999;Daietal.,2019；2020)，但由于华山松大小蠹和蓝变真菌诱导寄主华山松萜类合酶相关基因研究的滞后，成为制约揭示华山松大小蠹发生机制的关键因素之一。本研究针对华山松大小蠹入侵危害的特异性，以2年生华山松幼苗为试验材料，利用MeJA处理和接种秦岭细粘束孢模拟华山松大小蠹和蓝变真菌的入侵危害，克隆受华山松大小蠹和蓝变真菌危害后寄主华山松萜类合酶中alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因cDNA的全长，分析alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表达特性，为深入了解华山松大小蠹和蓝变真菌抵御华山松抗性的分子机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂 试验材料为2年华山松幼苗；Plant RNA Kit植物总RNA提取试剂盒购于Omega Bio-Tek公司；反转录试剂盒FastKing RT Kit(With gDNase)反转录试剂盒购于天根生物有限公司；EasyPure®Quick Gel Extraction Kit购于北京全式金生物技术有限公司；pMD®18-T载体购于北京全式金生物技术有限公司；Trans5α Chemically Competent Cell购于北京全式金生物技术有限公司；2×EasyTaq®PCR SuperMix购于北京全式金生物技术有限公司；Trans2K®Plus DNA Marker购于北京全式金生物技术有限公司；RACE试剂盒SMARTer RACE cDNA Amplification Kit购于TaKaRa公司；茉莉酸甲酯(纯度≥95%)购于Sigma-Aldrich公司；秦岭细粘束孢分离自秦岭火地塘林区被害华山松蓝变韧皮部和木质部组织。

1.2 华山松韧皮部总RNA的提取及cDNA第1链的合成 切取健康的华山松韧皮部组织，放入液氮中充分研磨，使用Plant RNA Kit植物总RNA提取试剂盒提取华山松韧皮部总RNA。提取的总RNA使用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量，NanoDrop超微量分光光度计测定总RNA的浓度和OD值。cDNA第一链合成利用FastKing RT Kit(With gDNase)反转录试剂盒完成。

1.3 华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因保守区cDNA片段的扩增 根据NCBI已报道其他松科植物alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的序列(Trindadeetal.,2016;Halletal.,2013;Byun-McKayetal.,2006;Martinetal.,2004)，使用DNAMAN进行比对，根据保守区设计简并引物(表1)，扩增alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因片段。引物由上海生物工程有限公司合成，产物的反应体系为20 μL，包括1 μL cDNA模板，上下游引物各0.5 μL，10 μL 2×EasyTaq®PCR SuperMix和8 μL RNase-free H2O。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的条带，将目的条带连接到pMD®18-T载体上，转化到大肠埃希菌(Escherichiacoli)感受态细胞中，筛选阳性克隆子送往生工生物工程(上海)公司测序。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的3′RACE扩增 根据保守片段的测序结果，设计基因特异性上游引物(表1)，并分别与3′RACE试剂盒中对应引物3′RACE Outer Primer和3′RACE Inner Primer组合，进行巢式PCR，以获得alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的3′非翻译区。第一轮PCR扩增反应体系与程序同上，以第一轮扩增的PCR产物为模板进行第二轮扩增。用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的条带，将目的条带连接到pMD®18-T载体上，转化到大肠埃希菌感受态细胞，筛选阳性克隆子送往生工生物工程(上海)公司测序。将测序所得的片段用DNAMAN进行拼接，获得含有3′末端的alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的部分序列。

1.5 alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的5′RACE扩增 根据DNAMAN的拼接结果，设计基因特异性下游引物(表1)，并分别与5′RACE试剂盒中的对应引物5′RACE Outer Primer和5′RACE Inner Primer组合进行巢式PCR，以获得alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的5′非翻译区。第一轮PCR扩增反应体系与程序同上，以第一轮扩增的PCR产物为模板进行第二轮扩增。用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的条带，将目的条带连接到pMD®18-T载体上，转化到大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆子送往生工生物工程(上海)公司测序。将测序所得的片段与3′RACE的拼接序列用DNAMAN进行拼接，获得华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的cDNA序列。

1.6 华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因基因序列分析 对克隆获得的基因进行序列分析，在NCBI上对华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因序列同源性比对，使用在线工具ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)推导基因编码蛋白质的分子量及理论等电点，通过SWISS-MODEL进行同源建模，构建三级结构模型。选取蛋白同源性较高的植物的蛋白序列，利用MEGA7.0软件构建系统发育树。

1.7 MeJA处理 将MeJA溶于0.1%(体积分数)吐温20(Tween 20)溶液中，配置成体积分数有0.01%的MeJA溶液，取100 mL溶液，在20 min内均匀喷洒于华山松幼苗上，以0.1%(体积分数)的Tween 20溶液为对照。每个处理重复15株，共处理30株。在处理的0 (未处理)、2、4、8和16 天取样，于-80 ℃保存。

1.8 秦岭细粘束孢处理 在华山松幼苗距地面15 cm处用直径5 mm打孔器钻孔，将秦岭细粘束孢接种于各孔中，用保鲜膜包裹，对照组幼苗只打孔，不接种真菌，每个处理重复15株，共处理30株。在处理的0(未处理)、2、4、8和16天取样，于-80 ℃保存。

1.9 实时荧光定量PCR反应 用实时荧光定量PCR分析华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因，选用18S RNA为内参基因(Phametal.,2016)，用Primer Premier 6.0设计荧光定量PCR的引物(表1)。分别提取MeJA和秦岭细粘束孢处理后0、2、4、8、16天的华山松韧皮部和对照组总RNA。总RNA提取和第一链cDNA合成方法同上。以合成的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析。生物学重复为3次，技术性重复为2次。采用log22-ΔΔCt法计算基因相对表达量。用SPSS 26.0进行显著性分析，GraphPad 8.0.2作图。

2 结果与分析

2.1 华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因全长 利用PCR与RACE技术从华山松中克隆出alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因全长cDNA。华山松alpha-pinene synthase基因编码区长度为1887 bp，共编码628个氨基酸，其编码蛋白的分子量为71.59 kDa，理论等电点(pI)为5.86，该基因序列已提交至GenBank，登录号为MW234460。Expasy Protscale对alpha-pinene synthase基因蛋白的亲水性分析，表明该蛋白是亲水性蛋白。华山松(-)-limonene synthase基因编码区长度为1 905 bp，共编码634个氨基酸，其编码蛋白的分子量为73.01 kDa，理论等电点(pI)为5.97，该基因序列已提交至GenBank，登录号为MW234461。在线软件Expasy Protscale对(-)-limonene synthase基因蛋白的亲水性进行分析，表明该蛋白是亲水性蛋白。通过SWISS-MODEL的Automated Mode华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因进行同源建模，构建三级结构模型(图1)。

图1 华山松TPS基因三级结构预测Fig.1 Tertiary structure analysis of TPS gene in P. armandi

2.2 华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因编码氨基酸序列分析 利用NCBI中的Blastx比对alpha-pinene synthase基因编码的氨基酸序列，结果显示华山松alpha-pinene synthase基因与马尾松的相似度分别为84.90%，与海岸松的相似度分别为84.10%，与北美云杉的相似度为82.96%；华山松(-)-limonene synthase基因与挪威云杉的相似度为82.39%，与北美云杉的相似度为82.39%。

TPS根据其蛋白序列的相关性分为6类，即Tpsa、Tpsb、Tpsc、Tpsd、Tpse和Tpdf(Bohlmannetal.,1998;Keelingetal.,2006;Trappetal.,2001)，其中裸子植物的TPS基因与被子植物亲缘关系较远，形成了相对独立的家族(Bohlmannetal.,1998)，即Tpsd，该基因家族又被分为单萜合成酶(Tps-d1)、倍半萜合成酶(Tps-d2)和二萜合成酶(Tps-d3)3类(Keelingetal.,2006;Byun-McKayetal.,2006)。根据alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因编码氨基酸序列的比对结果，选取裸子植物其他物种的TPS基因编码的氨基酸序列，通过MEGA7.0构建系统发育进化树(图2)，结果表明华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均属于Tpsd-1家族，并且华山松alpha-pinene synthase基因与松属的alpha-pinene synthase基因在同一分支上，华山松(-)-limonene synthase基因与云杉属的(-)-limonene synthase基因在同一分支上。

图2 华山松TPS与其他裸子植物TPS基因系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree based on amino acid sequences of TPS gene from P. armandi and other gymnosperm

2.3 MeJA处理下华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表达特性 华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均受MeJA诱导表达(图3)，MeJA处理后alpha-pinene synthase基因表达量在第2、4 天显著增加，分别是对照的4.51、2.83倍，第2 天达到极显著水平。MeJA处理后(-)-limonene synthase基因表达量也呈上调趋势，在第2、4天比对照分别增加2.1、2.35倍。说明MeJA处理可以诱导华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表达。

图3 MeJA处理下华山松TPS基因表达分析Fig.3 Expression analysis of TPS gene of P. armandi in MeJA treatedt检验结果Student’s t-test：*，P<0.05；**，P<0.01.下同。The same below．

2.4 接种秦岭细粘束后华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表达特性 华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均受秦岭细粘束孢诱导表达，在处理后不同时间的表达量有不同程度的增加(图4)，接种秦岭细粘束孢后alpha-pinene synthase基因表达量在第4、8和16天达到显著水平，分别提高1.87、3.98和10.30倍，其中第16 天达到极显著水平。(-)-limonene synthase基因表达量在第4、16 天差异显著，分别提高4.55、8.88倍，并且在第16 天基因表达量达到极显著水平。说明华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在接种秦岭细粘束孢后均有不同程度的上调表达，但在接种后不同时间的表达强度存在差异。

图4 接种秦岭细粘束孢后华山松TPS基因表达分析Fig.4 Expression analysis of TPS gene of P. armandi in L. qinlingensis post inoculation

3 讨论

针叶树木抵御病虫害的防御体系包括原生性防御和诱导性防御(Tomlinetal.,1997;Huberetal.,2004)，在这2种防御中树脂起着十分重要的作用(Phillipsetal.,1999;Trappetal.,2001;Huberetal.,2004;Martinetal.,2005)。针叶树木树脂是由单萜，倍半萜和二萜树脂酸组成的混合物(Phillipsetal.,1999;Martinetal.,2002)，众多研究表明树脂是针叶树木抵御小蠹虫和共生蓝变真菌入侵危害重要抗性物质，特别是以树脂为主的挥发性萜类物质在抵御小蠹虫和蓝变真菌入侵寄主树木时发挥着更为重要的作用(Christiansenetal.,1987;Paineetal.,1997;Franceschietal.,2005)。华山松大小蠹是秦岭健康华山松的优势先锋害虫，携带的蓝变真菌是华山松大小蠹成功入侵的必要条件，当华山松遭受华山松大小蠹和蓝变真菌的侵害时，其体内的挥发性物质在种类和含量上发生改变，从而抵御华山松大小蠹和蓝变真菌的进一步伤害(Phametal.,2014)。

大量研究表明，通常用MeJA处理模拟昆虫或病原体的入侵危害，MeJA处理挪威云杉后能够诱导复杂的外伤性树脂反应，包括木质部中外伤性树脂导管的分化，单萜和二萜的积累增加，以及诱导酶活性、单萜合酶和二萜合酶的基因表达(Franceschietal.,2002;Martinetal.,2002;Fäldtetal.,2003)。Milleretal(2005)研究发现，象甲和MeJA能在北美云杉中诱导出相似的萜类防御反应。本研究用MeJA模拟华山松大小蠹入侵，研究华山松大小蠹危害后华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表达，结果表明华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在MeJA处理后韧皮部的表达量显著增加，并且alpha-pinene synthase基因在2天时转录水平达到最高峰，这与北美云杉MeJA处理后(-)-alpha-pinene synthase基因反应基本一致(Milleretal.,2005)。(-)-limonene synthase基因在4天时转录水平达到最高峰，与北美云杉(-)-limonene synthase基因在受伤后4～7天达到峰值的研究结果基本一致(Byun-McKayetal.,2006)，这进一步说明alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在针叶树木抵御有害生物危害中发挥着非常重要的作用。

Pham等的(2014)研究表明，接种秦岭细粘束孢可以诱导华山松幼苗韧皮部和木质部中单萜和倍半萜含量的升高，随蓝变真菌的入侵诱导寄主华山松分泌更多的树脂，以抵御菌丝生长和蔓延，从而使韧皮部和木质部萜类物质积累。Tholl(2006)研究表明针叶树木产生的萜类化合物受萜类合酶基因调控，其中alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的调控作用最为显著。本研究在秦岭细粘束孢接种华山松后，华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在不同时间均有明显的响应，且在处理后不用时间变化存在显著差异，这说明华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的上调表达是秦岭细粘束孢诱导的结果，华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因是抵御华山松大小蠹和蓝变真菌入侵的主要因素之一。

4 结论

本研究克隆了华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因，alpha-pinene synthase基因cDNA编码区全长为1 887 bp，编码628个氨基酸，编码蛋白的相对分子质量为71.59 kDa，理论等电点为5.86，属于亲水性蛋白；(-)-limonene synthase基因cDNA编码区全长为1905 bp，编码634个氨基酸，编码蛋白的相对分子质量为73.01 kDa，理论等电点为5.97，属于亲水性蛋白。华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在MeJA处理和秦岭细粘束孢接种后表达量上调，是寄主华山松响应华山松大小蠹和蓝变真菌入侵危害的关键基因，也在寄主华山松抵御华山松大小蠹和蓝变真菌入侵危害中发挥着重要作用，这一研究结果对进一步解析秦岭巴山林区华山松大小蠹的发生机制具有重要的理论价值。