微波提取五指毛桃总黄酮工艺研究

唐 森， 石佳香， 覃逸明， 吴国勇， 张 鹏*

（1.广西科技师范学院 食品与生化工程学院，广西来宾546199；2.广西科技师范学院 特色瑶药资源研究与开发重点实验室，广西来宾546199；3.广西科技师范学院 科研管理处，广西来宾546199）

五指毛桃（Ficus hirta Vahl）是桑科榕属植物，又名粗叶榕、五指牛奶、土北芪等，因其叶片形状像五指而得名（钟小清，2001）。研究表明，其含有黄酮类、有机酸、氨基酸、三萜、生物碱、香豆素类等较多的活性成分及人体所需的矿质元素（王伟伟等，2013；林慧等，2012），具有抗氧化、补益、提高免疫力、消炎镇痛、平滑肌调节等作用，同时还能改善并保护消化和呼吸系统（赵帅等，2020；郭晨等，2019；李南薇等，2013；吕颖坚等，2008）。

目前，微波辅助提取技术广泛应用于较多天然产物的提取，而且微波辅助方法具有选择性高、穿透力强、加热效率高等特点 （Uquiche等，2008）。用微波辅助提取总黄酮可加快提取时间，而且提取效率较高，因而本试验用乙醇为溶剂，通过微波辅助的方法提取五指毛桃中的总黄酮。综上，本试验在单因素试验的基础上，以五指毛桃总黄酮提取量为评价指标，分别考察液料比、提取时间、提取功率、乙醇质量分数对五指毛桃总黄酮提取量的影响。使用响应面分析法对五指毛桃中总黄酮的提取工艺条件进行优化，为五指毛桃的后续研究提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂 供试材料：五指毛桃购于亳州市众益堂中药材销售有限公司，经鉴定为五指毛桃。

供试试剂：试验所用芦丁，超纯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢，分析纯（西隆科学股份有限公司）。

1.2 仪器与设备FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；FA2004B型电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；XH-MC-1型祥鹄微波合成反应仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHZ-D（III）型循环水多用真空泵（巩义市科瑞仪器有限责任公司）；C-20型玻璃仪器气流烘干器（上海贝仑仪器设备有限公司）；UV-9600型紫外/可见分光光度计（北京北分瑞利分析仪器（集团）公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 原料前处理及样品溶液的制备 用高速多功能粉碎机将五指毛桃原料粉碎，过60目筛后铺开置于托盘中，在70℃的条件下，电热恒温鼓风干燥箱中烘干4 h后，装袋备用。

称取五指毛桃粉末2.00 g置于三颈烧瓶中，加入一定量的乙醇为提取溶剂，摇匀后用塞子塞住，静置30 min，然后用微波合成提取仪进行提取，最后将提取后的溶液抽滤，取滤液用相同体积分数的乙醇定容，保存备用。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法（李建凤等，2020；Sakanaka等，2005），并稍作修改，精密称取0.0200 g的芦丁标准品，用70%的乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中，配制成0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液，摇匀备用。分别精密吸取0.2 mg/mL的芦丁标准品对照溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL置于10 mL具塞比色管中，加入质量分数为70%的乙醇溶液，使得溶液的总体积为2 mL，摇匀，再依次分别加入5%的亚硝酸钠0.3 mL，摇匀静置6 min，再加入10%的硝酸铝0.3 mL，摇匀静置6 min，最后加入10%的氢氧化钠3.0 mL，摇匀静置15 min。另取70%的乙醇同上操作做空白对照，在最大吸收波长510 nm处测定吸光值。横坐标为芦丁质量浓度（mg/mL），纵坐标为吸光度值进行线性回归，绘制标准曲线。B=10.216A+0.0734，R2=0.9992，线性范围：0.0214～0.0713 mg/mL。

1.3.3 五指毛桃总黄酮的测定 精密吸取五指毛桃样品提取液2.0 mL于10 mL具塞比色管中，同标准曲线绘制操作方法测定样品提取液的吸光度值，根据样品液的吸光值和标准曲线回归方程计算总黄酮提取量。五指毛桃中总黄酮提取量的计算：将样品提取液的吸光度值代入芦丁回归方程公式中，可得测定的供试样品溶液的总黄酮浓度（C），再计算出样品中的总黄酮提取量。

总黄酮提取量/（mg/100 g）=C×V×N/M×100；

式中：C为粗提取样液中总黄酮的浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；M为植物粉末样品质量，g。

1.3.4 单因素试验 以液料比20:1、提取时间4 min、提取功率400 W、乙醇质量分数70%为单因素试验基础条件，以五指毛桃总黄酮提取量为指标，分别考察4个单因素对五指毛桃总黄酮提取量的影响。其中，液料比分别为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1（mL/g）；提取时间分别为1、2、4、6、8 min；提取功率分别为200、300、400、500、600 W；乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%。

1.3.5 五指毛桃总黄酮微波辅助提取工艺条件的优化 响应面优化分析法是一种由数学和统计学二者相结合并且能够精准的表达响应值与各因素之间关系的常用方法（王永菲等，2005）。本试验在单因素试验的基础上，通过使用处理软件Design-Expert.V8.0.6设计四因素三水平的响应面分析试验，从而选出液料比（mL/g）、提取时间（min）、提取功率（W）、乙醇质量分数（%）四个自变量的最优值。响应面因素水平设计见表1。

表1 响应面因素水平表

1.4 数据分析 所有试验数据重复3次取平均值，采用SPSS 22.0软件进行数据统计及分析，并用Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计。

2 结果与分析

2.1 五指毛桃黄酮提取的单因素试验结果

2.1.1 液料比对五指毛桃总黄酮提取量的影响由图1可知，液料比为10:1～20:1（mL/g）时，总黄酮提取量增加，应该是随着溶剂用量的增加，溶剂与五指毛桃粉接触更充分，总黄酮提取量增大，在20:1时达到最大值，此后再增加70%乙醇溶剂用量时，总黄酮提取量下降。产生这种现象的原因可能是当液料比增加到一定值时，会在体系内出现与黄酮竞争溶剂的现象，从而导致总黄酮提取量下降（薛菁等，2017）。故最佳液料比定为20:1（mL/g）。

图1 液料比对五指毛桃总黄酮提取量的影响

2.1.2 提取时间对五指毛桃总黄酮提取量的影响由图2可知，总黄酮提取量在1～4 min时，随着微波时间的增加而增加，可能是因为时间的加长，微波辐射量增加，体系内分子加速运动，使五指毛桃中的总黄酮加快提出，总黄酮提取量增加，在4 min时提取量到达最高值，若此时继续延长微波提取时间，总黄酮提取量则开始随时间的加长而下降。原因可能是微波时间过长，使溶剂挥发过多，也可能是微波辐射过量，温度过高使五指毛桃中的黄酮被降解，从而总黄酮量下降（秦明有，2018）。故确定最优提取时间为4 min。

图2 提取时间对五指毛桃总黄酮提取量的影响

2.1.3 提取功率对五指毛桃总黄酮提取量的影响由图3可知，微波功率为200～400 W时，随着微波功率的增大，总黄酮提取量增加，这可能是因为功率增大，使溶剂与原料充分接触，利于总黄酮溶解，提出量增加，且到400 W时取得最大值，此时，若微波功率继续增大，总黄酮提取量开始下降。原因可能是在微波功率增大的同时，温度和溶剂的挥发速度以及总黄酮的降解速度也会随之加快，使得总黄酮提取量下降（朱新鹏等，2020）。所以取最佳提取功率为400 W。

图3 提取功率对五指毛桃总黄酮提取量的影响

2.1.4 乙醇质量分数对五指毛桃总黄酮提取量的影响 由图4可知，在乙醇质量分数为50%～70%时，总黄酮提取量随着乙醇质量分数的增加而提高，在70%时达到最大值，此时提高乙醇质量分数，总黄酮提取量开始下降。原因可能是当乙醇质量分数达到一定值后，若继续增大会使五指毛桃中的其他脂溶性或色素等杂质溶出，从而影响总黄酮的测量，造成总黄酮提取量的下降（陈婷等，2016）。故最佳乙醇质量分数确定为70%。

图4 乙醇质量分数对五指毛桃总黄酮提取量的影响

2.2 响应面优化分析与试验结果

2.2.1 模型建立与方差分析 以液料比（A）、提取时间（B）、提取功率（C）、乙醇质量分数（D）为因素，五指毛桃总黄酮提取量（Y）为指标设计试验，中心点设计5个重复试验。响应面优化试验设计条件与结果如表2所示。

用Design-Expert软件对表2中五指毛桃总黄酮的含量与四因素进行回归方程的拟合。拟合的回归方程模型为：Y=351.90+0.47A+3.36B+4.06C+3.50D-0.98AB-1.89AC+2.03AD-9.94BC-4.34BD-7.49CD-19.63A2-10.67B2-11.02C2-8.99D2。

表2 响应面试验条件与结果

通过回归方程方差分析，可以看出不同的提取因素对五指毛桃黄酮提取量的不同影响程度，结果如表3所示。

由表3可看出，模型中F=28.03，P＜0.0001，表明该模型极显著。C、BC、CD、A2、B2、C2、D2差异性极显著，B、D差异高度显著，BD差异显著，其他项不显著。失拟项（P=0.1299＞0.05）不显著，表明该模型与试验值差异较小，该二次回归方程有意义，因此能较好的进行预测。R2=0.9656，表明该模型拟合程度较好，试验误差较小；从F值可看出，在试验范围内各个单因素对五指毛桃黄酮提取量影响程度大小顺序为：提取功率＞乙醇质量分数＞提取时间＞液料比。

表3 响应面回归方程的方差分析

2.2.2 响应面图形分析 在响应面分析中，可以通过拟合响应面值的形状来分析各变量对响应值的影响；等高线形状可以判断出交互效应的强弱；曲线图的陡峭幅度可以表明各因素的影响程度大小主次关系。在平面直角坐标系中用响应值五指毛桃总黄酮提取量（Y）与两个变量绘制响应曲面图和等高线图，结果见图5～10。

从图5、6、7可以看出，响应面等高线图趋于圆形，且结合方差分析结果可知，液料比与提取时间、液料比与提取功率、液料比与乙醇质量分数这3组因素之间交互关系不显著。又从三维曲面图可以看出，提取时间、提取功率、乙醇质量分数的坡面均较液料比的坡面陡峭，则说明提取时间、提取功率、乙醇质量分数对五指毛桃的总黄酮提取量影响显著，液料比影响不显著。

图5 总黄酮提取量随液料比与提取时间变化的等高线图与曲面图

由图8、9、10可以看出，响应面等高线图呈椭圆形，且结合方差分析的结果可知，提取时间与提取功率、提取时间与乙醇质量分数、提取功率与乙醇质量分数这三组因素之间的交互关系显著。从三维曲面图可以看出，提取功率的坡面较提取时间的坡面陡峭；乙醇质量分数的坡面较提取时间的坡面陡峭；提取功率的坡面较乙醇质量分数的坡面陡峭，则说明提取功率对五指毛桃的总黄酮提取量影响极显著，提取时间、乙醇质量分数影响高度显著。

图6 总黄酮提取量随液料比与提取功率变化的等高线图与曲面图

图7 总黄酮提取量随液料比与乙醇质量分数变化的等高线图与曲面图

图8 总黄酮提取量随提取时间与提取功率变化的等高线图与曲面图

2.3 最优工艺参数的确定 经过Design-Expert8.0.6软件建立响应面优化分析，可以得到提取五指毛桃总黄酮的最佳工艺条件为：液料比20.12：1（mL/g），提取时间4.16 min，提取功率410 W，乙醇质量分数71.34%，五指毛桃含量的预测值为352.48 mg/100 g。为了验证该工艺条件的真实性及让试验易于操作，综合考虑将料液比定为20:1（mL/g），提取时间为4 min，提取功率为400 W，乙醇质量分数为71%，在此条件下进行验证试验，重复试验3次，其平均值为351.93 mg/100 g，通过计算可知五指毛桃总黄酮提取量的实际值与预测值的相对误差为0.087%，误差较小，这说明该模型具有可信度，优化方法可行、操作性较好。

图9 总黄酮提取量随提取时间与乙醇质量分数变化的等高线图与曲面图

图10 总黄酮提取量随提取功率与乙醇质量分数变化的等高线图与曲面图

3 结论

本试验结果表明，乙醇-微波辅助提取五指毛桃总黄酮最佳工艺条件为：液料比20:1（mL/g），提取时间4 min，提取功率400 W，乙醇质量分数71%。经过验证试验得五指毛桃总黄酮提取量为（351.93±0.25）mg/100 g，具有一定的可靠性与参考价值，该试验一定程度上为五指毛桃的后续开发与研究提供了依据与参考价值。