长链非编码RNA BRE-AS1在非小细胞肺癌中的表达及其调控功能

王娴，张艳秋，申娴，尹立红，浦跃朴，梁戈玉

1.东南大学 a.公共卫生学院 b.环境医学工程教育部重点实验室，江苏 南京 210000

2.江苏省泰州市疾病预防控制中心环境职业卫生科，江苏 泰州 225300

肺癌是中国新发病例和死亡人数最多的癌症［1］。2020年，中国肺癌新发病例数为815 563，占新发癌症数的17.9%；因肺癌死亡714 699人，占癌症总死亡人数的23.8%［2］。除遗传因素外，吸烟、汽车尾气、雾霾等环境因素是肺癌的主要危险因素［3］。肺癌最主要的病理学亚型为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），占比超过80%［4］。大多数NSCLC 患者发现时已为癌症末期，难以治愈［5］。此外，许多NSCLC患者会在手术后复发［6］，这些癌症末期和复发患者的生存率很低［5］。因此，世界卫生组织呼吁进一步探索NSCLC 的发病机制，在NSCLC 的诊断和治疗中应重视分子生物标志物，以便早期筛查，监测疾病进展，提供治疗靶标，改善患者预后。

长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类不编码蛋白质的调节性RNA，其异常表达与多种疾病有关，包括恶性肿瘤［7］。研究发现lncRNAs参与了NSCLC 的发生发展，如BRCA1 相邻基因2 通过调控Notch1 信号通路抑制NSCLC 上皮间充质转化进程［8］，过渡前相关RNA 可促进NSCLC 细胞增殖、迁移和侵袭［9］，叉头蛋白F1 毗连非编码发育调控RNA 通过与miR-761 结合并调节尿金属蛋白酶2 表达来抑制NSCLC 的发展［10］。目前人细胞中鉴定出的lncRNA 超过50 000 种，大多数lncRNA 的表达、作用和机制尚不明确，迫切需要进一步研究。

本课题组前期应用芯片筛选NSCLC 相关lncRNAs，发现脑和生殖器官表达蛋白反义RNA 1（brain and reproductive organ-expressed protein antisense RNA 1，BRE-AS1）在NSCLC 中表达下调［11］。BRE-AS1是长度为1 659 bp的非编码RNA，位于2p23.2染色体［12］。脑和生殖器官表达蛋白（brain and reproductive organ-expressed protein，BRE）是存在各种组织中稳定细胞蛋白，主要功能为DNA 损伤修复和抗细胞凋亡［13］。BRE-AS1可调控多种肿瘤细胞的生物学功能。例如，BRE-AS1可通过与miR-145-5p 相互作用调节前列腺癌细胞的增殖和凋亡［14］；过表达BRE-AS1可以通过抑制信号转导和转录激活因子3 的磷酸化抑制膀胱癌细胞增殖［15］，但BRE-AS1在NSCLC中的功能尚未明确。因此，本研究从多角度检测BRE-AS1在NSCLC中的表达，并探索BRE-AS1的诊断能力、生物学功能以及调控机制，为进一步了解NSCLC 发病机制提供新的理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本次研究收集91 例原发性NSCLC 患者（无放疗或化疗史）的肿瘤组织及其配对癌旁组织样本，患者来自江苏省南京市胸科医院。采集后立即置于RNA保存液中，4℃过夜后-20℃保存备用，同时记录所有患者临床信息。人支气管样上皮细胞（16HBE）、人肺泡上皮细胞（HpAEpiC）、NSCLC 细胞（A549 和NCI-H1395）均来自环境医学工程教育部重点实验室，均采用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM 培养基于37℃培养箱中培养。本研究已通过东南大学附属中大医院伦理委员会审批（编号：2014ZDSYLL031.0），并获得患者签署的知情同意书。

1.2 试剂与仪器

RNA保存液（Tiandz，中国），TRIzol试剂（Invitrogen，加拿大），RIPA裂解液（汉恒，中国），特异引物（捷瑞，中国），胎牛血清（四季青，中国），SYBR Green试剂盒（Promega，美国），双抗（国药集团，中国），培养基（四季青，中国），A214 试剂盒（GenStar，中国），KGA512周期检测试剂盒（凯基，中国），CCK8试剂（Beyotime，中国），异丙醇（国药集团，中国），KGA107 凋亡检测试剂盒（凯基，中国），BRE-AS1过表达慢病毒及相应的阴性对照慢病毒（汉恒，中国），嘌呤霉素（白鲨易，中国）；NanoDrop 2000 光谱仪、酶标仪（Thermo Fisher Scientific，美国），StepOnePlus实时PCR（Applied Biosystems，加拿大）等。

1.3 方法

本研究首先检测了BRE-AS1在NSCLC 组织样本和不同肺癌细胞中的表达，同时分析了BRE-AS1在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中的表达，和组织及细胞的表达相互印证，并评估了BRE-AS1的诊断能力及与NSCLC 临床特征之间的关系；其次通过慢病毒转染在肺癌A549 细胞中过表达BRE-AS1，检测BRE-AS1对细胞增殖、周期和凋亡的影响；最后通过功能富集分析BRE-AS1的下游通路，并通过Western blotting法检测BRE-AS1对下游磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路关键蛋白的影响。

1.3.1 NSCLC 组织和细胞中BRE-AS1 表达的检测及分析应用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技术检测组织或细胞中BRE-AS1的表达。首先用TRIzol 试剂从组织或细胞中提取总RNA，并用NanoDrop 2000光谱仪测量纯度和浓度。再用A214 试剂盒将RNA 逆转录成cDNA。通过StepOnePlus 实时PCR 系统检测目标mRNA 表达。PCR 反应组分包括1 μL cDNA、5 μL SYBR Qpcr Mix、0.1 μL 特异引物和3.8 μL 无酶水。反应条件为预变性95℃ 1 min；变性95℃ 15 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 30 s，共40个循环。特异引物序列见表1。BRE-AS1表达水平采用2-ΔΔCt法计算，用差异表达倍数（fold change，FC）表示BRE-AS1在各组织中的差异表达情况，FC=-1/2-ΔΔCt。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线及其曲线下面积评价BRE-AS1的诊断能力。应用独立样本t检验分析不同临床特征（性别、年龄、肿瘤淋巴结转移分期、病理类型）的NSCLC 患者的BRE-AS1表达水平有无差异。

表1 lncRNA BRE-AS1 和内参基因GAPDH 的引物序列Table 1 Primer sequences of lncRNA BRE-AS1 and GAPDH

1.3.2 TCGA 数据库中BRE-AS1 表达分析从TCGA 数据库（更新于2020年10月）下载1 016 例NSCLC 患者肿瘤组织与110 例正常肺组织测序数据。应用TCGA RNASeqV2 系统提取NSCLC 组织与正常肺组织中lncRNABRE-AS1表达数据。采用受者工作特征曲线及其曲线下面积评价BRE-AS1诊断能力。

1.3.3 构建BRE-AS1 过表达A549 肺癌细胞模型通过慢病毒转染，过表达A549 细胞中的BRE-AS1，并设置三个实验组：LV-BRE-AS1组、阴性组和空白组。将BRE-AS1过表达慢病毒和阴性对照慢病毒用感染增强液稀释至1×108TU·mL-1，感染融合度50%左右的A549细胞，72 h 后用含2 μg·mL-1嘌呤霉素的培养基持续培养两周后得到LV-BRE-AS1组和阴性组，正常培养细胞为空白组。最后利用RT-qPCR 技术检测慢病毒转染效率。

1.3.4 细胞增殖能力检测使用CCK8 法检测过表达BRE-AS1对A549 细胞增殖能力的影响。将LV-BRE-AS1组和阴性组细胞种于96 孔板（每孔3 000 个细胞）中正常培养12、24、36、48 h 后，每孔中加入10 μL CCK8试剂，在37℃下反应2 h 后，在酶标仪中于450 nm 波长处测量光密度值。

1.3.5 细胞周期与凋亡检测使用KGA512 周期检测试剂盒评估过表达BRE-AS1对A549 细胞周期的影响。各实验组收集1×106个细胞，逐步加入0.5 mL乙醇，混匀后4℃过夜。在洗净的细胞沉淀中加入0.1 mL的RNaseA，置于37℃水浴锅中30 min，加0.4 mL RNaseA PI 混匀后4℃避光反应30 min，使用流式细胞仪检测488 nm处与DNA结合的PI红色荧光强度。

使用KGA107凋亡检测试剂盒评估过表达BRE-AS1对A549 细胞凋亡的影响。A549 细胞转染96 h 后，各实验组收集1×106个细胞，洗净的细胞沉淀中加入0.1 mL结合缓冲液、0.005 mL Annexin V-APC 和0.01 mL 7-ADD 混匀后避光放置15 min，加0.38 mL 结合缓冲液后，1 h 内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3.6 富集分析和蛋白分析通过差异分析TCGA和课题组前期三对NSCLC 及癌旁组织芯片测序的数据［11］获得NSCLC 相关差异mRNA，并取交集。然后，通过R 语言cluster profiler 包进行功能富集分析，包括基因本体论（Gene Ontology，GO）富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），分析寻找受lncRNABRE-AS1影响的信号通路。

应用Western blotting法检测PI3K-AKT-mTOR信号通路中关键蛋白表达水平的变化。收集细胞并用RIPA裂解液提取总蛋白后，电泳分离蛋白条带后转膜，封闭后置于4℃孵育一抗（兔抗人IgG-HRP）过夜。一抗孵育后洗涤，加入二抗（山羊抗兔IgG-HRP）室温孵育1 h。蛋白表达由ECL 化学发光系统测量。

1.4 统计学分析

应用SPSS 22.0 软件和Excel 2016 软件进行统计分析。结果以均数±标准差表示。应用t检验、卡方检验和单因素方差分析各组之间的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 BRE-AS1 在NSCLC中表达

RT-qPCR 结果显示，与癌旁组织相比，BRE-AS1在NSCLC 组织中表达下调（FC=-13.15，P＜0.05，图1A）。TCGA 数据库分析结果显示，与正常组织相比，BRE-AS1在NSCLC 组织中表达也下调（FC=-4.85，P＜0.05，图1B）。此外，细胞检测结果表明，与16HBE 和HpAEpiC 细胞相比，A549 细胞中BRE-AS1表达下调（FC=-4.87，P＜0.05，图1C），而NCI-H1395 中BRE-AS1表达无统计学差异（P＞0.05，图1C）。

图1 BRE-AS1 在NSCLC组织（A、B）及细胞（C）中的表达水平Figure 1 Expression levels of BRE-AS1 in NSCLC tissues (A and B)and cells (C)

2.2 BRE-AS1 对NSCLC的诊断能力

结果如图2所示，肺癌患者组织BRE-AS1诊断的ROC 曲线下面积为0.916，95%CI为0.872～0.960，灵敏度为85.6%，特异度为85.7%（图2A）；TCGA 数据库中BRE-AS1诊断的ROC 曲线下面积为0.853，95%CI为0.809～0.897，灵敏度为84.5%，特异度为66.1%（图2B），提示BRE-AS1对NSCLC 具有较高的诊断能力。

图2 BRE-AS1 诊断NSCLC的ROC曲线Figure 2 ROC curve of BRE-AS1 in predicating NSCLC

2.3 不同临床特征的NSCLC患者的BRE-AS1 表达差异

不同性别和病理类型的NSCLC 患者的BRE-AS1表达水平存在差异（P＜0.05），男性患者低于女性，肺鳞状细胞癌患者低于肺腺癌患者（表2）。不同年龄和肿瘤淋巴结转移分期的NSCLC 病人的BRE-AS1表达水平无统计学差异（P≥0.05）。

表2 不同临床特征的NSCLC 患者的BRE-AS1 表达差异分析Table 2 Expressions of BRE-AS1 in NSCLC patients with different clinical characteristics

2.4 过表达BRE-AS1 抑制A549细胞增殖

以A549 细胞作为研究对象，并利用慢病毒构建BRE-AS1过表达稳转细胞株（图3A-C）。图3D 结果表明，与阴性组相比，LV-BRE-AS1组的光密度值在24、36、48 h 降低（P＜0.01），提示过表达BRE-AS1可抑制A549细胞的增殖。

图3 BRE-AS1 过表达稳转细胞株的构建（A、B、C）及BRE-AS1 对A549细胞增殖的影响（D）Figure 3 Building stable BRE-AS1 over-expressed cells (A,B,and C)and effect of BRE-AS1 over-expression on A549 cell viability (D)

2.5 过表达BRE-AS1 影响A549细胞周期与凋亡

细胞周期检测结果显示，与阴性组相比，LVBRE-AS1组中S 期比例降低，G2/M 期中比例升高（P＜0.01），提示过表达BRE-AS1可阻滞A549 细胞周期于G2/M 期（图4A）。细胞凋亡检测结果表明，与阴性组相比，LV-BRE-AS1组的晚期凋亡和总凋亡比例增加（P＜0.05），提示BRE-AS1过表达可诱导A549 细胞凋亡（图4B）。

图4 BRE-AS1 过表达对A549细胞周期（A）和细胞凋亡（B）的影响Figure 4 Effect of BRE-AS1 over-expression on cell cycle (A) and cell apoptosis (B) in A549 cells

2.6 过表达BRE-AS1 对PI3K-AKT-mTOR 信号通路的影响

功能富集分析发现，NSCLC 相关差异mRNA 主要富集于133 种基因功能条目以及22 种信号通路（图5A、5B，P＜0.05），其中PI3K-AKT信号通路基因富集数量最多，因此，推测BRE-AS1可能通过PI3K-AKT 信号通路介导NSCLC 生物功能。Western blotting 分析结果表明，与阴性组相比，LV-BRE-AS1组中AKT3、p-AKT3、mTOR、p-mTOR 表达降低，PTEN 表达增高（图5C、5D），且p-AKT3/AKT3 及p-mTOR/mTOR 也降低（图5E、5F，P＜0.05），提示过表达BRE-AS1可抑制PI3K-AKTmTOR 信号传导途径。

图5 非小细胞肺癌中BRE-AS1 相关的GO（A）和KEGG（B）富集分析及蛋白印迹分析结果（C-F）Figure 5 BRE-AS1 related GO (A) and KEGG (B) enrichment analysis results in NSCLC and Western blotting results (C-F)

3 讨论

近年来，NSCLC 新发和死亡病例逐年增多，疾病负担严重。由于缺乏有效筛查手段，早期NSCLC 难以及时发现，晚期及复发NSCLC 难以治愈［16］，因此NSCLC 生存率很低［17］，迫切需要进一步探索NSCLC 的发病机制，为寻找更加有效、实用、经济的生物标志物提供理论依据［18］。

随着分子生物学技术的不断成熟［19］，越来越多的lncRNA被发现。lncRNA是转录长度超过200 nt 但缺乏蛋白质编码能力的RNA 分子，研究表明其具有调控肿瘤发生发展的能力［20］。例如被转化生长因子β 激活的长链非编码RNA 在肝癌、结直肠癌、胃癌和肺癌等多种肿瘤中异常表达，并且可以通过结合miRNA 诱导上皮间质转化来促进肿瘤发生和进展［21］；lncRNA 肺癌相关转录物1 在肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤中高表达，可通过多种机制调节肿瘤的增殖、侵袭和迁移［22］。这些研究提示lncRNA 也可能在NSCLC 发生发展中发挥重要作用。

课题组前期对原发性NSCLC 组织lncRNA 芯片检测中发现，BRE-AS1在癌组织中表达下调［11］。为进一步探讨BRE-AS1在NSCLC中的作用，本研究首先检测了NSCLC患者组织、TCGA数据库、NSCLC细胞中BRE-AS1表达，发现BRE-AS1在NSCLC 组织及细胞中表达下调，进一步分析发现，BRE-AS1对NSCLC具有较高的诊断价值，且男性患者BRE-AS1的表达水平明显低于女性，肺鳞状细胞癌患者明显低于肺腺癌患者，提示BRE-AS1和男性肺鳞状细胞癌患者的发病关系更加密切。既往研究发现了一些与NSCLC 相关的重要lncRNA，如被转化因子β 激活的长链非编码RNA、lncRNA 肺癌相关转录物1 和烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1 等在NSCLC中表达上调［21-23］，转录超保守区454 等在NSCLC 中表达下调［24］。关于BRE-AS1的报道较少，Zhang 等［12］通过GEO 数据库分析同样发现BRE-AS1在NSCLC 中表达下调，与本研究结果相互印证。

通过细胞实验进一步揭示BRE-AS1在NSCLC 中的功能，结果显示过表达BRE-AS1可抑制NSCLC 细胞增殖，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡。既往研究显示不同lncRNAs 对NSCLC 细胞功能的影响不同，如过表达过渡前相关RNA 可促进A549 细胞增殖、迁移和侵袭［9］，敲低lncRNA X 染色体失活特异性转录物可抑制细胞增殖并促进细胞凋亡［25］，而过表达转录超保守区454 则会抑制A549 细胞迁移和侵袭［24］。既往报道与本研究均显示BRE-AS1对肿瘤（膀胱癌、前列腺癌、肺癌）细胞功能的影响主要体现在抑制细胞增殖和促进细胞凋亡方面［12，14-15］，提示BRE-AS1在NSCLC中具有抑癌作用。

lncRNA在肿瘤中存在多种调控机制，如转录、翻译、细胞内信号通路、蛋白质修饰以及RNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质复合物形成等，其中通过信号通路来调控肿瘤的发生发展是最普遍的方式之一［26］。Peng等［20］报道lncRNAs可通过影响Notch、PI3K-AKT-mTOR、核因子κB等多种信号通路来调控肿瘤发生发展。为探讨BRE-AS1调控NSCLC 细胞功能的潜在分子机制，本研究首先通过富集分析发现PI3K-AKT 可能是BRE-AS1的重要下游通路。目前已知PI3K-AKT通路的激活可以促进多种癌症包括肺癌的发生［27］，其中关键分子AKT活化后可进一步磷酸化mTOR 来介导细胞增殖、周期和糖代谢［28］，故常常将PI3K-AKT信号通路与mTOR 信号通路放一起研究。mTOR 主要调节细胞生长、能量代谢及细胞骨架重建［29］，另一关键蛋白PTEN 活化后主要抑制细胞生长并诱导细胞凋亡［30］。本研究通过Western blotting实验对上述关键蛋白及其磷酸化水平进行检测，结果发现BRE-AS1可能通过抑制PI3K-AKTmTOR信号传导通路来发挥抑癌作用。

目前关于BRE-AS1在NSCLC 中作用的报道较少。本研究利用RT-qPCR 技术以及TCGA 数据库分析，从多方面检测BRE-AS1的表达并相互验证，结果准确可信。本研究仍然存在一定的局限性，仅采用过表达BRE-AS1进行细胞实验，缺乏体内实验的验证。因此，未来将结合体内实验进一步阐明BRE-AS1在NSCLC 发生发展中的作用。

综上所述，本研究首先检测分析了BRE-AS1在NSCLC 组织样本、TCGA 数据库和不同肺癌细胞中的表达，并评估了BRE-AS1的诊断能力，发现BRE-AS1在NSCLC 中低表达且具有较高的诊断能力；其次通过慢病毒转染在A549 中过表达BRE-AS1，检测BRE-AS1对细胞增殖、周期和凋亡的影响；最后通过功能富集和Western blotting 检测分析BRE-AS1对下游PI3K-AKT-mTOR信号通路关键蛋白的影响，发现BRE-AS1可能通过抑制PI3K-AKT-mTOR 信号通路来抑制NSCLC细胞生长、诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期，研究为进一步了解NSCLC 发病机制及筛选新的候选生物标志提供依据。