二甲双胍调节miRNA表达治疗2型糖尿病及其并发症的研究进展

李 婷,张 策,赵乃倩*

(1山西医科大学第二临床医学院内分泌科,太原 030001;2山西医科大学基础医学院;*通讯作者,E-mail:407288101@qq.com;#共同通讯作者,E-mail:1951584811@qq.com)

根据世界卫生组织的统计数据,目前全世界约有4.22亿人患有糖尿病,预计到2035年,患病人数将增加至5.92亿[1],其中约90%-95%为2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)[2]。T2DM是一种以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷为特征的慢性代谢性疾病,其慢性并发症包括糖尿病缺血性心脏病、糖尿病缺血性脑血管病和糖尿病缺血性下肢血管病等大血管病变,以及糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病神经病变等微血管病变,是T2DM患者致残和致死的主要原因[2]。二甲双胍是T2DM治疗中使用最广泛的一种双胍类降糖药,主要通过减少肝脏葡萄糖生成和增加外周胰岛素敏感性降低血糖[3]。二甲双胍还可通过降低低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平、减少炎症介质释放、改善血液高凝状态和拮抗氧化应激保护血管内皮功能[3]。但二甲双胍降低血糖和保护血管内皮功能的分子机制尚未完全阐明。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为19-25个核苷酸的非编码单链RNA分子,在细胞中调节大多数基因的转录后表达,在细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、新陈代谢等生物学过程中发挥关键作用[[4-7]。研究显示,二甲双胍可改变多种miRNA的表达,而这些miRNA与T2DM患者胰岛素抵抗、血管平滑肌细胞增殖和肝脏异位脂质沉积等病理改变密切相关,说明调节miRNA表达可能是二甲双胍降低血糖、改善糖尿病转归的重要机制[6]。本文对目前二甲双胍调节miRNA表达治疗T2DM及其并发症的研究进展做一评述,旨在为进一步了解miRNA的功能和调节、进一步明确T2DM的发病机制和改善T2DM及其并发症的防治提供参考。

1 miRNA的生成、调节和功能

1.1 miRNA的生成

目前,关于miRNA的生成机制是较为明确的。miRNA的生物合成始于初级miRNA(primary miRNA,pri-miRNA)转录本的转录后加工。在细胞核中,基因组中相应的基因序列在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录为pri-miRNA，单链pri-miRNA分子形成茎环结构,随后被Drosha酶剪切成前体miRNA(precursor-miRNA,pre-miRNA)。这一过程在微处理器复合体Drosha/DGCR8(DiGeorge syndrome chromosome region 8,DGCR8)上进行,DGCR8为RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)DiGeorge综合征染色体8区。pre-miRNA在输出蛋白5的作用下转运至细胞质,被Dicer酶剪切成成熟双链miRNA。这一过程在Dicer与反式激活反应RBP(trans-activation-responsive RNA-binding protein,TRBP)相结合形成的蛋白复合体Dicer/TRBP上进行。双链miRNA随即与Argonaute(Ago)蛋白结合,形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC中的双链miRNA被解旋为两条单链,其中的成熟miRNA链仍与RISC结合,过客链经降解而失活。与Ago蛋白结合的成熟miRNA被组装成含miRNA的RISC(miRNA-containing RISC,miRISC)。miRISC中成熟miRNA 5′端的第2-8位核苷酸与靶mRNA的3′非翻译区(untranslated regions,UTR)或5′-UTR或开放阅读框完全或不完全配对结合,进而影响靶基因的表达[8](见图1)。

图1 普遍miRNA的生成和功能

1.2 miRNA的调节

机体对miRNA的调节分转录调节和转录后调节。在转录调节方面,miRNA的调节机制与其他RNA的调节机制相似。miRNA的转录后调节在两个不同的层次上进行。其一为调节pri-miRNA转录后加工过程中共用的微处理器复合体等重要结构组分的表达水平和活性。比如Drosha酶和Dicer酶在miRNA的生成过程中发挥关键作用,这两种酶表达水平和活性的变化对miRNA的表达具有直接影响。其二为不同pri-miRNA独特的核苷酸序列和结构特征影响其与pri-miRNA转录后加工过程中涉及的一些复合体结构的相互作用,这些复合体结构中不同的RBP促进了这种相互作用[5]。比如不同pri-miRNA发卡环和二级结构的差异可改变在微处理器复合体Drosha/DGCR8上和蛋白复合体Dicer/TRBP上进行的剪切加工过程。值得注意的是,miRNA与特定mRNA的相互作用可引起miRNA与Ago蛋白的解离和miRNA3′端的修饰,并最终影响miRNA的降解,这也是一种转录后调节[9]。miRNA被核糖核酸酶降解而失活。基因缺失、基因重排、缺氧以及疾病等内外环境因素均可通过以上机制影响miRNA的表达。

1.3 miRNA的功能

miRNA调节靶mRNA表达有mRNA翻译抑制、mRNA切割和mRNA降解3种作用方式。mRNA翻译抑制发生于miRNA和靶mRNA部分配对的情况下,由miRISC中的Ago蛋白和Ago结合蛋白GW182介导。mRNA切割发生于miRNA和靶mRNA完全配对的情况下,由miRISC中具有切割活性的Ago蛋白2执行。而mRNA降解可能是miRNA降低mRNA水平的主要方式,当mRNA翻译受到抑制时,引发mRNA的脱帽、脱尾反应,随后mRNA从5′端或3′端开始降解,而mRNA受到切割时也可触发降解机制而开始降解[9](见图1)。目前研究证实,miRNA在细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、新陈代谢和能量平衡等众多生物学过程中起关键作用,提示miRNA功能失调可能会对多种疾病进程产生重大影响,包括代谢性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤等。

2 二甲双胍调节miRNA表达治疗T2DM及其并发症

2.1 二甲双胍调节miRNA表达治疗T2DM

T2DM始于与肥胖相关的胰岛素抵抗,其分子机制为胰岛素靶组织胰岛素信号转导通路活性的抑制。随着胰岛素抵抗的持续发展,胰岛素分泌失代偿,血糖水平逐渐升高,最终进展为T2DM[2]。miRNA可调节胰岛素信号转导及脂肪组织的发育、分化和代谢等过程,miRNA功能失调是T2DM胰岛素抵抗的重要发病机制,而逆转T2DM患者的miRNA功能失调是二甲双胍降糖作用分子机制的重要组成部分[6]。二甲双胍调节miRNA表达治疗T2DM的机制引起研究者的关注。

2.1.1 T2DM状态下胰岛素信号转导通路活性减低 胰岛素与胰岛素受体结合并使其活化,进而识别与结合胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1),使IRS1的关键酪氨酸残基磷酸化,进而募集细胞内的衔接蛋白,激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)。PI3K激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,AKT)信号级联,通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游效应物,抑制糖异生,促进糖原、脂肪和蛋白质合成,使血糖降低[10-12](见图2)。肥胖和T2DM状态下升高的游离脂肪酸可抑制IRS1的活化,损伤下游的PI3K/AKT信号转导活性,引起血糖升高[10]。改善肥胖和T2DM状态下胰岛素信号转导通路活性是降糖作用的关键所在。

图2 胰岛素促进合成代谢的信号转导通路

2.1.2 二甲双胍调节miRNA表达改善胰岛素信号转导 miR-221是与肥胖、T2DM和胰岛素抵抗密切相关的一种miRNA。在肥胖人群的脂肪组织中miR-221表达水平显著升高,且与体质指数的增加显著正相关[13]。T2DM患者血清miR-221水平显著高于健康对照者,且与体质指数、胰岛素抵抗指数、糖化血红蛋白A1c和甘油三酯水平显著正相关[14]。在3T3-L1脂肪细胞中,过表达miR-221可诱导胰岛素抵抗,抑制miR-221表达可减轻胰岛素抵抗,改善胰岛素敏感性[15]。荧光素酶分析显示,miR-221可直接与IRS1和PI3K mRNA的3′UTR结合,抑制IRS1和PI3K的表达[16,17]。研究证实,miR-221是IRS1/PI3K/AKT胰岛素信号转导通路的重要调节因子。与对照组相比,使用二甲双胍的T2DM患者内乳动脉中miR-221表达显著减少,且miR-221表达与二甲双胍剂量显著负相关。二甲双胍还可剂量依赖地抑制人胰腺癌PANC-1细胞、血管内皮祖细胞以及RAW264.7巨噬细胞的miR-221表达。上述研究表明,二甲双胍可能通过抑制miR-221表达改善T2DM患者的胰岛素信号转导,从而达到治疗T2DM的作用,这也为研究如何改善T2DM患者的胰岛素抵抗提供了新思路。

2.1.3 二甲双胍调节miRNA表达改善脂肪组织功能 肥胖是胰岛素抵抗和T2DM发生发展的重要原因。机体持续摄入高热量饮食的情况下,前脂肪细胞过度增殖、分化致使成熟脂肪细胞数量增加,成熟脂肪细胞又因细胞内甘油三酯蓄积而体积增大,导致白色脂肪组织过度膨胀而形成肥胖[18]。人体白色脂肪组织的过度膨胀促成了T2DM及其并发症的发生发展[19]。miRNA是脂肪细胞分化、脂肪代谢和胰岛素作用等与肥胖有关的生物学过程的重要调节因子,可加速或抑制脂肪细胞的分化,从而调节脂肪组织功能。miRNA在肥胖脂肪组织中的表达水平与正常脂肪组织相比存在着明显的差异,表明miRNA功能失调参与了肥胖的发病过程。在细胞培养研究中,二甲双胍可抑制前脂肪细胞的分化,而且二甲双胍处理前脂肪细胞的miRNA表达谱与对照细胞相比存在着明显差异。其中miR-1246和miR-3687表达水平在二甲双胍处理后显著增加,而miR-378家族成员表达水平则显著降低。增加miR-1246和miR-3687表达和降低miR-378家族成员表达可抑制前脂肪细胞的分化[20]。动物实验显示,miR-378家族成员基因缺陷小鼠进食高脂饮食后并不出现肥胖。因此,二甲双胍可能通过调节miRNA表达改善脂肪组织功能,进而防止肥胖、胰岛素抵抗和T2DM的发生发展。这提示在二甲双胍治疗T2DM的过程中,其对脂肪组织功能的改善作用不容忽视。

2.2 二甲双胍调节miRNA表达治疗糖尿病大血管病变

糖尿病大血管病变的本质是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),内皮细胞功能障碍是其始动因素[21]。在此基础上,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,SMC)去分化、迁移至动脉内膜并增殖,使内膜增厚,而弥漫性内膜增厚正是脂肪纹形成的部位。在脂肪纹的部位,受损的内皮细胞持续募集单核/巨噬细胞和平滑肌细胞等细胞至内膜下间隙,引起慢性炎症反应,使脂肪纹转化为纤维帽和粥样斑块等更复杂的病变。无论从糖尿病动物还是从糖尿病个体分离的SMC,其迁移和增殖活性均显著增加。在糖尿病患者的AS病变中,单核/巨噬细胞以及多种炎性因子的浸润更为明显[22,23]。因此,T2DM患者具有更严重的AS病变。

miRNA在血管稳态、血管生成和修复中起重要作用。在T2DM患者中,与血管功能有关的miRNA表达谱发生了明显改变,表明miRNA功能异常参与了AS病变的发生发展。miR-221和miR-222是与SMC迁移和增殖有关的miRNA,两者可直接与抑制细胞生长的周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27和p57 mRNA的3′UTR结合,降低p27和p57的蛋白表达水平,促进SMC的迁移和增殖[24]。在行冠状动脉旁路移植术治疗患者的内乳动脉中,与非糖尿病患者以及使用二甲双胍治疗的糖尿病患者相比,未使用二甲双胍治疗糖尿病患者的miR-221和miR-222表达水平显著增加。在使用二甲双胍治疗糖尿病患者的内乳动脉中,miR-221和miR-222的表达水平与二甲双胍剂量显著负相关。从未使用二甲双胍治疗的糖尿病患者内乳动脉中分离出的SMC增殖速度较其他两组显著增快[6,24]。表明二甲双胍可通过下调miR-221和miR-222的表达水平,延缓糖尿病患者血管内膜的增厚速度。

let-7家族成员在调节AS病变的炎症反应中起着关键作用,可抑制SMC的迁移和增殖、单核/巨噬细胞的黏附以及核因子κB炎症信号通路的活化[23]。T2DM心血管疾病患者血循环let-7家族成员水平显著降低,糖尿病患者颈动脉斑块和糖尿病相关AS小鼠模型的AS斑块中let-7家族成员表达水平显著降低[12,23],表明let-7家族成员表达水平降低促成了T2DM大血管病变的发生发展。使用二甲双胍治疗的T2DM心血管疾病患者,血循环let-7水平可恢复至正常水平[25]。采用生活方式联合二甲双胍治疗的T2DM患者,let-7a和let-7f表达水平显著增加[6],表明二甲双胍可能通过上调let-7家族成员的表达水平,延缓糖尿病患者AS病变的发生发展。

心肌细胞凋亡在糖尿病心血管疾病方面的作用也不容忽视。miR-1a-3p具有诱导心肌细胞凋亡的作用[26]。miR-1a-3p可与葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein 94,GRP94)mRNA的3′UTR结合,抑制GRP94的表达。GRP94是一种内质网(endoplasmic reticulum,ER)分子伴侣,参与ER蛋白的折叠、转运和分泌等过程,可避免ER应激的发生。ER应激可诱导C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达,进而通过启动下游信号转导通路促进细胞凋亡[27]。miR-1a-3p过表达可使GRP94表达降低,使未折叠或错误折叠的蛋白质分子显著增加,引起ER应激,诱导CHOP表达,导致细胞凋亡。将大鼠心肌细胞分为两组,实验组用H2O2处理诱导心肌细胞损伤,对照组在二甲双胍孵育一段时间后再使用H2O2处理。结果显示,实验组miR-1a-3p表达水平较对照组显著增加,心肌细胞活力则显著降低[26],表明二甲双胍可通过抑制miR-1a-3p表达,抑制心肌细胞凋亡,延缓糖尿病患者心肌损伤的发生发展。这些研究提示,二甲双胍通过调节相关miRNA的表达延缓T2DM患者AS和心肌损伤的发生发展,进而对改善T2DM的预后起到有益作用。

2.3 二甲双胍调节miRNA表达治疗糖尿病微血管病变

二甲双胍调节miRNA表达治疗糖尿病微血管病变的研究主要见于糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病。

糖尿病视网膜病变以视网膜是否出现新生血管为标志,分为背景型视网膜病变和增殖性视网膜病变两大类。血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)是糖尿病视网膜病变发展过程中最重要的调节因子,可增加血管通透性并促进新生血管的形成。生物信息学分析显示,miR-497a-5p可与VEGF-A mRNA的3′UTR结合,抑制其翻译为蛋白质。糖尿病视网膜病变小鼠使用二甲双胍治疗后,其视网膜病变程度明显减轻,同时眼部的miR-497a-5p表达水平显著增加,VEGF-A蛋白水平显著降低[28],提示二甲双胍可通过上调miR-497a-5p抑制VEGF-A蛋白表达,延缓糖尿病视网膜病变的发生发展。

糖尿病肾病主要指糖尿病性肾小球硬化症,其主要特征是肾小球系膜区细胞外基质蛋白Ⅰ型胶原α2链(collagen type 1-α2,Col1a2)和Ⅳ型胶原α1链(Col4a1)沉积,而肾小管间质纤维化是进展为晚期糖尿病肾病,导致肾功能衰竭的关键性因素。在肾小球系膜区细胞外基质的沉积中,转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)起重要作用,而let-7家族成员表达异常介导了TGF-β的作用。在TGF-β处理的小鼠系膜细胞(mouse mesangial cell,MMC)中,let-7家族成员的表达水平显著减低,而Col1a2和Col4a1的表达水平显著增加,其机制与let-7b与Col1a2和Col4a1 mRNA的3′UTR结合,抑制两者的表达有关。与对照小鼠相比,糖尿病小鼠肾小球中let-7b水平显著降低,Col1a2和Col4a1水平显著升高,进一步证实了let-7b抑制肾小球纤维化的作用。二甲双胍可显著升高T2DM患者血浆let-7水平[22],表明二甲双胍可能通过上调let-7延缓糖尿病肾病肾小球纤维化的发生发展。肾小管间质纤维化是近端肾小管上皮细胞(proximal tubule epithelial cell,PTC)在TGF-β的驱动下发生上皮-间质转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)所致。E-钙黏蛋白(E-cadherin)在肾小管间质纤维化的形成和发展中具有重要作用。在PTC中,锌指E-盒结合同源异形盒ZEB1(zinc-finger E-box-binding homeobox1,ZEB1)和ZEB2可与E-cadherin基因启动子中的E-盒结合,进而抑制E-cadherin基因转录。E-cadherin表达减少是发生EMT的主要机制,多种miRNA参与E-cadherin表达的调节,以miR-192最为重要。miR-192高表达于肾皮质,过表达miR-192可通过抑制ZEB1和ZEB2表达诱导E-cadherin表达。糖尿病肾病患者的肾组织活检显示,miR-192表达显著减低,且与肾小管间质纤维化显著负相关,提示miR-192表达减低可能是糖尿病肾病肾小管间质纤维化的重要原因[29]。T2DM患者在二甲双胍治疗3个月后,约50%患者血浆miR-192水平显著增加,提示二甲双胍可能通过上调miR-192表达诱导E-cadherin表达,抑制肾小管间质纤维化,延缓糖尿病肾病的进展[30]。二甲双胍通过调节miRNA表达改善糖尿病微血管病变的治疗作用值得深入研究。

2.4 二甲双胍调节miRNA表达治疗非酒精性脂肪肝

胰岛素抵抗是非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)和T2DM的共同发病机制。T2DM患者的NAFLD患病率显著升高,约为非糖尿病患者的5倍[31]。合并NAFLD的T2DM患者心血管疾病、慢性肾脏疾病和增殖性视网膜病变的发病风险显著高于未合并NAFLD的T2DM患者[32]。与对照小鼠相比,高脂饮食(high-fat diet,HFD)小鼠肝脏脂质蓄积显著增加,形成了NAFLD,并且两组小鼠肝组织中的miRNA表达谱具有显著差异[33],表明miRNA表达异常可能是NAFLD的原因。与对照小鼠相比,进食甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食的小鼠肝脏脂质蓄积显著增加,形成了NAFLD,并且其肝组织中有71个miRNA表达水平显著升高,60个miRNA表达水平显著下降。而同时进食甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食和服用二甲双胍的小鼠,肝脏脂肪变性和肝纤维化显著减轻,并且其肝组织中原来71个表达水平显著升高的miRNA中,miRNA-376a、miRNA-127、miRNA-34a、miRNA-300和miRNA-342-3p表达水平显著下降,原来60个表达水平显著下降的miRNA中,miRNA-122、miRNA-194、miRNA-101b和miRNA-705表达水平显著升高。其中,miRNA-122是一种肝脏特异性的miRNA,具有改善肝脏脂质代谢和抑制肝细胞增殖的作用,miRNA-122a功能缺失可诱导肝脂肪变性、肝纤维化和肝癌形成。表明二甲双胍可通过上调miRNA-122表达延缓NAFLD的发生发展[34]。miR-291b-3p是另一种调节肝脏脂质代谢的miRNA。与对照小鼠相比,瘦素受体基因缺陷T2DM(db/db)小鼠和HFD小鼠肝脏脂质蓄积显著增加,形成了NAFLD,同时其肝组织中miR-291b-3p表达水平显著增加。抑制肝脏miR-291b-3p表达可减轻HFD小鼠的肝脂肪变性[35]。荧光素酶分析显示,miR-291b-3p可与AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)α1 mRNA的3′UTR结合,抑制AMPKα1的表达[35]。二甲双胍可减轻HFD小鼠的肝脏脂质蓄积并降低其肝组织中miR-291-3p的表达水平,表明二甲双胍可通过下调miR-291b-3p的表达,增加AMPKα1的表达和活性以延缓NAFLD的发生发展[35]。鉴于引起NAFLD miRNA表达谱的复杂性,二甲双胍调节miRNA表达改善NAFLD的作用及其机制有待进一步阐明。

3 二甲双胍调节miRNA表达的分子机制

二甲双胍是一种AMPK激动剂,其对于T2DM的治疗作用主要是通过激活AMPK途径实现的。二甲双胍调节miRNA表达也始于AMPK的激活,由此根据所调节miRNA的不同而分别进入转录调节和转录后调节两条不同的通路。在miRNA的转录调节方面,二甲双胍可抑制肌肉组织特异性miR-1a-3p的表达,其分子机制是二甲双胍通过激活AMPK显著降低CCAAT/增强子结合蛋白(CCTTA/enhancer binding proteins,C/EBP)β的表达水平[22]。C/EBPβ是一种重要的转录因子,参与靶基因转录的调节,可通过与下游靶基因启动子结合而诱导靶基因表达[33]。C/EBPβ表达水平降低,其与miR-1a-3p基因启动子的结合减少,进而抑制miR-1a-3p的表达[22]。这可能是二甲双胍调节特异性miRNA表达的一种普遍而重要的分子机制。在miRNA的转录后调节方面,二甲双胍可同时调节多种miRNA的表达,其分子机制是二甲双胍通过激活AMPK使AU碱基富集区RNA结合因子1(AU-rich element binding factor,AUF1)磷酸化。AUF1是调节Dicer1(人和小鼠中负责miRNA生成的唯一Dicer酶)表达的关键因子。AUF1可通过与Dicer1mRNA的3′UTR和编码区相互作用,降低Dicer1mRNA的稳定性,进而抑制Dicer1的表达[36]。如前所述,转运至细胞质的pre-miRNA在Dicer的作用下形成成熟双链miRNA,这是miRNA生成过程中不可缺少的一个环节。AUF1的磷酸化增强了AUF1与热休克蛋白70的结合,使得AUF1得以从细胞质穿梭至细胞核中,从而改变了AUF1的亚细胞定位。细胞质中AUF1与Dicer1 mRNA的相互作用因而减弱,致使Dicer1的表达水平增加,并最终使得一系列miRNA的表达水平发生改变[37]。这可能是二甲双胍同时调节多种miRNA表达的一种普遍而重要的分子机制。

4 结论与展望

综上所述,调节miRNA表达是二甲双胍治疗T2DM及其并发症的一种重要机制。从二甲双胍调节的miRNA可以看到,一些miRNA具有多种调节功能,比如miR-221既可损伤胰岛素信号转导通路又可诱导血管内皮损伤后的动脉内膜增厚;同一种功能又由多种miRNA调节,比如miR-1246、miR-3687和miR-378都可调节前脂肪细胞的分化。从二甲双胍调节miRNA表达的分子机制可以看到,既有特异性miRNA特有的调节机制,比如二甲双胍通过激活AMPK/C/EBPβ/miR-1a-3p信号通路抑制miR-1a-3p表达,又有多种miRNA共有的调节机制,比如二甲双胍通过激活AMPK使AUF1磷酸化,AUF1从细胞质进入细胞核,AUF1对Dicer1的抑制作用减弱,致使Dicer1表达增强。充分证明了miRNA功能和调节miRNA表达的复杂性。

有关二甲双胍调节miRNA表达治疗T2DM的研究,还有一些问题需要引起我们关注。首先,目前的大多数研究是在动物体内和细胞培养条件下进行的,其研究结论有待更多的人体研究予以确立。其次,有些临床研究并未对所研究的miRNA家族的家族成员进行分别检测,致使研究结论的不确定性有所增加。再次,目前尚无二甲双胍调节miRNA表达治疗糖尿病神经病变方面的研究。最后,关于二甲双胍调节miRNA表达分子机制的研究极其有限,更多miRNA特有的调节机制和更多的共有调节机制有待阐明。深入研究这些问题,有助于进一步揭示T2DM及其并发症的发病机制,为药物研发提供新思路,从而有助于T2DM及其并发症的防治。