lncRNA MALAT1靶向miR-532-3p对脑出血继发脑损伤大鼠脑微血管内皮细胞模型凋亡和氧化损伤的影响

权 瑜,王举波,程格庆,李 娜,李小冬,屈 佩,王茂德

(1西安交通大学第二附属医院神经外科,西安 710004;2西安交通大学第一附属医院神经外科;*通讯作者,E-mail:maodewang@163.com)

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一种严重的脑血管疾病,发病率逐年增加且呈低龄化趋势,然而,尽管针对该病的临床治疗方法取得了显著进展,但45岁以上患者的死亡率仍较高[1]。研究表明,氧化应激在ICH继发性脑损伤中起着重要作用,可诱导脑微血管内皮细胞(CMECs)损伤,进而破坏血脑屏障、引起脑水肿和细胞凋亡[1]。因此,有效减轻CMECs氧化损伤对防治ICH继发性脑损伤意义重大。

长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本,可通过调节基因表达参与调控CMECs功能,在脑血管疾病进展中发挥功能[2,3]。lncRNA肺癌转移相关转录本1(MALAT1)最初被认为与肺癌如小细胞肺癌的恶性转移有关[4],随后在结肠癌[5]等其他肿瘤中均被证实具有致癌作用。近年研究[6]指出,糖尿病性肾病小鼠肾皮质中MALAT1表达增加,干扰其表达可逆转高糖诱导的足细胞损伤;另外,在冠心病的研究中发现,敲低MALAT1可增强心肌细胞活力、促进细胞周期进程,并抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡[7]。然而,MALAT1在ICH时CMECs中的表达情况及其是否参与CMECs损伤,尚无研究。

由生物信息分析[8]发现,miR-532-3p是MALAT的下游潜在靶点,可抑制脑缺血/再灌注所致氧化应激损伤,但MALAT1是否可通过靶向miR-532-3p进而参与ICH时CMECs的氧化损伤尚不清楚,因此,本研究拟采用过氧化氢(H2O2)诱导大鼠CMECs(RCMECs)模拟ICH继发性脑损伤的CMECs状态,进而研究MALAT1和miR-532-3p表达对ICH继发性RCMECs凋亡和氧化损伤的影响,并探讨MALAT1和miR-532-3p在其中的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大鼠脑微血管内皮细胞RCMECs及其专用完全培养基购于武汉普诺赛生命科技公司;H2O2购于苏州晶瑞化学有限公司;逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq、miRNA第一链合成试剂盒、miRNA qPCR试剂盒购于大连Takara公司;MALAT1小干扰RNA(si-MALAT1)及其对照(si-NC)、miR-532-3p模拟物(miR-532-3p mimics)及其对照(miR-mimics-NC)、miR-532-3p抑制物(miR-532-3p inhibitor)及其对照(miR-inhibitor-NC)、异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购于上海生工公司;大鼠丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒购于北京索莱宝公司;兔抗鼠B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗体、兔抗鼠β-肌动蛋白(β-actin)抗体、兔抗鼠Bcl-2相关x蛋白(Bax)抗体、羊抗兔IgG二抗购于上海碧云天公司;含有miR-532-3p结合位点的MALAT1野生型(WT)序列或其突变(MUT)体的荧光素酶报告载体WT-MALAT1、MUT-MALAT1由北京华大基因公司提供。

1.2 细胞培养和模型构建

RCMECs采用普诺赛公司RCMECs专用完全培养基进行培养。按照1 ∶3比例传代,取第3代对数期细胞进行实验。参考文献[9,10],用0.125 mmol/L的过氧化氢处理RCMECs 30 min以建立ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型。

1.3 双重荧光素酶报告基因实验

使用Starbase网站(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测MALAT的下游潜在靶点。利用Lipofectamine 2000将WT-MALAT1或MUT-MALAT1分别与miR-mimics-NC、miR-532-3p mimics共转染细胞,并分别定义为miR-mimics-NC组、miR-532-3p mimics组。培养48 h收集并裂解细胞,按照双重荧光素酶报告基因测定系统操作说明进行相对荧光素酶活性测定,以验证MALAT与miR-532-3p的靶向结合关系。

1.4 实验设计

1.4.1 验证MALAT1与miR-532-3p的靶向调控关系 RCMECs以2×105个细胞/孔的浓度接种于6孔板,细胞融合率为60%时,将细胞分为si-NC组和si-MALAT1组,分别使用Lipofectamine 2000转染si-NC和si-MALAT1,转染后48 h进行实时定量PCR(RT-qPCR)检测MALAT1及miR-532-3p的表达情况,以验证二者的靶向调控关系。

1.4.2 验证RCMECs氧化损伤模型中MALAT1和miR-532-3p的表达情况 同上进行细胞培养后,将细胞分为control组和H2O2组,control组为继续培养48 h的正常RCMECs,H2O2组为正常RCMECs经继续培养48 h后按照1.2.1的方法所建立的氧化损伤模型,control组和H2O2组均采用RT-qPCR检测RCMECs氧化损伤时MALAT1和miR-532-3p的表达情况。

1.4.3 验证沉默MALAT1对RCMECs氧化损伤模型凋亡和氧化损伤的影响 以control组及H2O2组作为对照,H2O2-si-NC组和H2O2-si-MALAT1组分别使用Lipofectamine 2000转染si-NC和si-MALAT1,转染48 h后按照1.2.1的方法建立氧化损伤模型,随后行RT-qPCR检测MALAT1表达,并检测细胞凋亡、MDA含量、SOD和CAT活性以及凋亡相关蛋白表达情况,以验证MALAT1对ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型的作用。

1.4.4 验证过表达miR-532-3p对RCMECs氧化损伤模型凋亡和氧化损伤的影响 以control组及H2O2组作为对照,H2O2-miR-mimics-NC组和H2O2-miR-532-3p mimics组分别转染miR-mimics-NC和miR-532-3p mimics,转染48 h后建立氧化损伤模型,随后行RT-qPCR检测miR-532-3p表达,并检测细胞凋亡、MDA含量、SOD和CAT活性以及凋亡相关蛋白表达情况,以验证miR-532-3p对ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型的作用。

1.4.5 验证抑制miR-532-3p对MALAT1沉默的RCMECs氧化损伤模型凋亡和氧化损伤的影响 以control组及H2O2组作为对照,H2O2-si-MALAT1+miR-inhibitor-NC组和H2O2-si-MALAT1+miR-532-3p inhibitor组分别共转染si-MALAT1与miR-inhibitor-NC、si-MALAT1与miR-532-3p inhibitor,转染48 h后建立氧化损伤模型,随后行RT-qPCR检测miR-532-3p表达,并检测细胞凋亡、MDA含量、SOD和CAT活性以及凋亡相关蛋白表达情况,通过Rescue实验验证MALAT1/miR-532-3p对ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型的作用及调控机制。

1.5 方法

1.5.1 RT-qPCR检测MALAT1和miR-532-3p表达 Trizol法提取细胞总RNA,按照逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq说明书进行RT-qPCR;β-actin作为内参检测MALAT1表达。为检测miR-532-3p表达,使用miRNA第一链合成试剂盒进行逆转录,再用miRNA qPCR试剂盒进行RT-qPCR;U6作为内参检测miR-532-3p表达。反应条件:94 ℃预变性2 min,94℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环。获取分析Ct值,并采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。MALAT1上游:5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′,下游:5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAA GGCA-3′;β-actin上游:5′-ACTGCCGCATCCTCTTCCT-3′,下游:5′-TCAACG TCACACTTCATGATGGA-3′;miR-532-3p上游:5′-CGTTTCCAACTGTATG-3′,下游:5′-CAACGGCGGATGGCC-3′;U6上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5.2 流式细胞术检测细胞凋亡 胰蛋白酶消化细胞样本,预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次,随后重悬细胞于500 μl的Annexin Ⅴ-结合缓冲液中。依次加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC、5 μl的PI,暗室染色15 min后,采用流式细胞术分析细胞凋亡。

1.5.3 MDA含量、SOD和CAT活性检测 收集细胞样本至离心管中,3 000 r/min离心10 min弃去上清。随后每4×106个细胞加入1 ml提取液,超声破碎细胞,4 ℃离心机10 000 r/min离心10 min后收集上清至冰上。按照各试剂盒步骤,分别采用黄嘌呤氧化酶法、化学发光法、放射免疫法测定MDA含量、SOD活性和CAT活性。

1.5.4 蛋白质印迹法(Western blot)检测Bcl-2和Bax表达量 RIPA缓冲液裂解细胞获得总蛋白样品,测定浓度、纯度合格后-20 ℃保存备用。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白,湿法转膜仪进行硝酸纤维素转膜。将膜置于5%脱脂牛奶中室温下孵育1 h封闭,随后置于兔抗Bcl-2、Bax、β-actin抗体溶液(稀释比例为1 ∶500)中室温下孵育2 h,再用对应羊抗兔二抗(稀释比例为1 ∶1 500)室温下孵育1 h。暗室内进行化学发光显色,凝胶成像系统分析各条带灰度值,目的蛋白和β-actin蛋白灰度值比值表示其相对表达量。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 MALAT1靶向调控miR-532-3p

使用Starbase网站预测显示,miR-532-3p与MALAT1之间存在潜在靶点(见图1)。miR-mimics-NC或miR-532-3p mimics分别与WT-MALAT1共转染后,与miR-mimics-NC组比,miR-532-3p mimics组的细胞相对荧光素酶活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-mimics-NC或miR-532-3p mimics分别与MUT-MALAT1共转染后,miR-mimics-NC组与miR-532-3p mimics组间细胞相对荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

图1 Starbase网站预测MALAT1与miR-532-3p的互补关系Figure 1 Starbase predicts the complementary relationship between MALAT1 and miR-532-3p

表1 MALAT1和miR-532-3p间的荧光素酶报告实验结果

由RT-qPCR可见,si-MALAT1组沉默MALAT1表达后,RCMECs中MALAT1相对表达量显著低于si-NC组,而miR-532-3p相对表达量显著高于si-NC组,差异均有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2 MALAT1靶向负调控

2.2 ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型中MALAT1和miR-532-3p表达

RT-qPCR结果显示,与control组比较,H2O2组RCMECs中MALAT1相对表达量显著升高,而miR-532-3p相对表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 RCMECs氧化损伤模型中MALAT1和miR-532-3p表达情况比较

2.3 沉默MALAT1对ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型凋亡的影响

与control组比较,H2O2组RCMECs中MALAT1相对表达量显著升高,凋亡率、Bax蛋白相对表达量显著升高,Bcl-2蛋白相对表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与H2O2-si-NC组比较,H2O2-si-MALAT1组RCMECs中MALAT1相对表达量显著降低,凋亡率、Bax蛋白相对表达量显著降低,Bcl-2蛋白相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05,见表4、图2)。

表4 沉默MALAT1对RCMECs氧化损伤模型凋亡的影响

图2 沉默MALAT1对RCMECs氧化损伤模型凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响Figure 2 Effect of silencing MALAT1 on apoptosis and expression of apoptosis-related proteins in oxidative damage model of RCMECs

2.4 沉默MALAT1对ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型氧化损伤的影响

与control组比较,H2O2组RCMECs中MDA含量显著增加,SOD和CAT活性显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与H2O2-si-NC组比较,H2O2-si-MALAT1组RCMECs中MDA含量显著降低,SOD和CAT活性显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05,见表5)。

表5 沉默MALAT1对RCMECs氧化损伤模型氧化损伤的影响

2.5 过表达miR-532-3p对ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型凋亡和氧化损伤的影响

与control组比较,H2O2组RCMECs中miR-532-3p相对表达量显著降低,凋亡率、Bax蛋白相对表达量、MDA含量显著升高,Bcl-2蛋白相对表达量、SOD和CAT活性显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与H2O2-miR-mimics-NC组比较,H2O2-miR-532-3p mimics组RCMECs中miR-532-3p相对表达量显著升高,凋亡率、Bax蛋白相对表达量、MDA含量显著降低,Bcl-2蛋白相对表达量、SOD和CAT活性显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05,见表6、图3)。

表6 过表达miR-532-3p对RCMECs氧化损伤模型凋亡和氧化损伤的影响

图3 过表达miR-532-3p对RCMECs氧化损伤模型凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响Figure 3 Effects of miR-532-3p overexpression on apoptosis and expression of apoptosis-related proteins in oxidative damage model of RCMECs

2.6 抑制miR-532-3p能逆转沉默MALAT1对ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型凋亡和氧化损伤的影响

与H2O2-si-MALAT1+miR-inhibitor-NC组比较,H2O2-si-MALAT1+miR-532-3p inhibitor组RCMECs中miR-532-3p相对表达量显著降低,凋亡率、Bax蛋白相对表达量、MDA含量显著升高,Bcl-2蛋白相对表达量、SOD和CAT活性显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,见表7、图4)。

表7 抑制miR-532-3p能逆转沉默MALAT1对RCMECs氧化损伤模型凋亡和氧化损伤的影响

图4 抑制miR-532-3p能逆转沉默MALAT1对RCMECs氧化损伤模型凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响Figure 4 Inhibition of miR-532-3p reverses the effect of silencing MALAT1 on apoptosis and expression of apoptosis related proteins of oxidative damage model of RCMECs

3 讨论

MALAT1参与细胞增殖、凋亡、分化等关键生物学过程,在多种器官、细胞损伤过程中均发现其表达异常。Wang等[11]研究发现糖氧剥夺和复氧诱导的心肌细胞中MALAT1表达增加,干扰MALAT1表达可抑制细胞自噬、降低乳酸脱氢酶释放,进而保护心肌细胞免受糖氧剥夺复氧损伤。Li等[12]报道睾丸缺血再灌注损伤发生时,MALAT1表达水平与细胞凋亡呈正相关,与细胞增殖呈负相关。此外,Yang等[13]证实MALAT1可通过激活p38MAPK通路促进大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞PC12凋亡和氧化应激从而加重缺氧对PC12细胞的损伤。在神经系统相关疾病中,MALAT1的研究相对较少,有研究发现MALAT1可导致人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中高敏C反应蛋白(hs-CRP)表达增加,而后者是急性脑梗死病理生理基础动脉粥样硬化的重要参与因子[14];MALAT1还可通过竞争性结合miR-145促进脑缺血再灌注损伤[15],然而,MALAT1是否参与ICH继发脑损伤,是否在ICH继发脑损伤的RCMEC凋亡和氧化损伤中发挥作用并不清楚。

本研究发现,采用H2O2诱导构建ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型后,MALAT1表达显著增加,功能缺失实验显示沉默MALAT1显著减弱细胞凋亡。Bcl-2和Bax是细胞重要调控蛋白,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加和促凋亡蛋白Bax表达减少可降低线粒体膜的通透性,抑制细胞色素C等凋亡激活因子的释放进而抑制细胞凋亡[16]。沉默MALAT1后RCMECs氧化损伤模型中Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达升高,与功能缺失实验结果吻合。另外,ICH发生后,大量氧自由基被释放,可导致膜脂质过氧化以及蛋白质和DNA氧化损伤[1],而SOD和CAT作为机体抗氧化系统的重要组成部分,在氧化应激时对组织和细胞具有保护作用。本研究中沉默MALAT1可显著提高RCMECs氧化损伤模型中SOD和CAT活性,并降低脂质过氧化产物MDA含量。以上研究均表明,沉默MALAT1可抑制H2O2诱导的RCMECs氧化损伤模型中细胞凋亡和氧化损伤。

大量研究证实lncRNA可通过与miRNA结合并抑制miRNA活性进而在人类疾病中发挥功能[17]。为探讨MALAT1的作用机制,本研究通过双荧光素酶报告实验证实MALAT1与miR-532-3p可靶向结合,且沉默MALAT1可显著上调miR-532-3p表达水平。miR-532-3p来源于miR-532的3′端臂,目前关于其的研究主要围绕肿瘤疾病,在心脑血管疾病方面,同样源于miR-532的miR-532-5p则研究较多。有研究显示,miR-532-5p可通过靶向心脏内与能量稳态相关的丙酮酸脱氢酶复合物,减轻缺氧引起的心肌细胞凋亡[18];可降低缺氧复氧诱导的心肌氧化应激反应,抑制细胞凋亡,减轻心肌细胞损伤[19,20];可通过PTEN/PI3K/AKT途径减轻缺氧复氧诱导的H9C2心肌细胞损伤[21],或通过上述途径减小脑梗死后的梗死灶面积并改善神经功能缺损、减少细胞凋亡[22];另外,在小鼠大脑中动脉闭塞模型中miR-532-5p表达降低,过表达miR-532-5p可显著改善模型小鼠神经功能障碍、减少梗死面积,并减轻神经元损伤和凋亡[23]。而来自同样miR-532前体的miR-532-3p,虽在肿瘤相关疾病中研究较多,被发现可通过阻断ETS1/TGM2介导的Wnt/β-catenin进而抑制结直肠癌进展[24],通过调控结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)表达抑制β-catenin信号通路进而抑制胃癌进展[25],通过靶向β-catenin抑制淋巴瘤进展[26],但在心脑血管疾病中的相关研究较少,仅仅被发现可通过靶向调控Caspase募集结构域参与阿霉素心脏毒性所致线粒体分裂和细胞凋亡[27],可通过抑制PAPD5表达参与动脉粥样硬化的进展[28],可通过靶向NADPH氧化酶2(NOX2)抑制脑缺血/再灌注所致氧化应激损伤[8],但无论miR-532-5p或miR-532-3p,是否在ICH中发挥作用尚不明确。

本研究显示,H2O2诱导构建ICH继发脑损伤的RCMECs氧化损伤模型后,RCMECs中miR-532-3p表达显著降低,过表达miR-532-3p可显著抑制Bax蛋白表达、促进Bcl-2蛋白表达、减轻RCMECs氧化损伤和凋亡,与沉默MALAT1的作用吻合。通过进一步恢复实验发现,抑制miR-532-3p还可部分逆转MALAT1沉默对H2O2诱导的RCMECs氧化损伤和凋亡的保护作用,这进一步证实靶向负调控miR-532-3p是MALAT1参与H2O2诱导的RCMECs凋亡和氧化损伤的重要机制。另外,其下游信号通路是否与miR-532-5p存在交叉,是否与其在调控肿瘤进展中的信号通路有关,尚需进一步深入研究。

总之,沉默MALAT1通过靶向上调miR-532-3p可抑制H2O2诱导的RCMECs凋亡和氧化损伤。因此,调控MALAT1/miR-532-3p途径可能是防治ICH继发性脑损伤的可能策略,然而上述途径的下游信号通路仍需进一步研究。