山奈酚调控AMPK/NOX4通路抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激和胞外基质积聚

玄露露，李彦秋，王怀杰，柳 凡，陈 莹，赵春贞，王荣申*，李万忠*

1潍坊医学院药学院，潍坊 261053；2山东大学齐鲁医学院，济南 250012

DN有多种发病机制，其中OS是DN中关键致病因素，系由ROS水平升高引起[2]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)家族(NOX 1-5和Duox 1-2)通过质膜将电子转移到氧分子上产生ROS，此为DN中ROS主要来源之一[3]。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)是DN患者肾脏中高度表达的NADPH亚型，是高糖诱导GMCs中OS产生的主要原因[3]。NOX4水平升高能够直接引起肾小球纤维化[2]。沉默NOX4表达将会减弱肾小球膜扩张、肾小球硬化和ECM积聚，揭示高糖刺激NOX4表达升高的分子机制及其涉及的上下游效应因子具有重要意义。

5′-腺苷单磷酸激活蛋白激酶(5′-adenosine monophosphate-activated protein kinases，AMPK)磷酸化可以阻断高糖诱导的NOX4表达，同时能够抑制肾成纤维细胞的异常增殖和激活[4]。Sestrins是一种重要的应激诱导蛋白家族，在维持细胞内环境稳定中起重要作用，其中Sestrin2是最重要的家族成员之一，可通过激活AMPK磷酸化，在保护细胞免受氧化损伤中起关键作用[5]。此外，AMPK可能是NOX激活的负调节剂，因为Sestrin2和AMPK激活可以抑制ROS，保护GMCs免受OS侵害[6]，表明激活Sestrin2和AMPK磷酸化可能具有预防DN作用。

基于OS和ECM积累已被证明在DN发病机理中起到重要作用，所以寻找具有抗氧化作用和减弱DN效应的中药及天然产物显得尤为迫切。黄酮类成分因其出色功效而引起越来越多的学者研究。山奈酚(kaempferol，KAE)是一种黄酮类化合物，已被证明具有多种药理活性。KAE通过抑制炎症反应和OS，减轻高血糖所致心脏损伤[7]；通过抑制RhoA/Rho激酶介导的炎症信号，从而改善DN[8]。目前，关于KAE通过调节AMPK/NOX4途径干预高糖诱导的GMCs OS和ECM积累的研究相对较少。本研究运用GMCs体外高糖模型，探讨KAE对高糖诱导的GMCs中OS和ECM积累的影响及其对DN的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

山奈酚(纯度≥98%，HPLC分析，成都曼斯特生物科技有限公司)；GMCs细胞(南京KeyGen生物技术公司)；DMEM培养基(南京KeyGen生物技术公司)；DMSO、DCFH-DA荧光探针、青链霉素、MTT、RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂(索莱宝生物技术公司)；BCA蛋白测定试剂盒和Trizol(江苏康为世纪有限公司)；Diphenylene iodonium(DPI，纯度：99.90%，HY-100965，上海MCE公司)；高灵敏度NADPH荧光定量试剂盒和Lipofectamine 2000(美国Sigma公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)(南京建成生物技术有限公司)；Compound C(纯度：99.65%，HY-13418A，上海MCE公司)；Anti-Sestrin2(ab236025，Abcam)；anti-phospho-AMPK(ab133448，Abcam)；anti-AMPK(ab80039，Abcam)；anti-NADPH oxidase 4(ab133303，Abcam)；anti-p22phox(ab75941，Abcam)；TGF-β1(ab92486，Abcam)；Collagen IV(ab6586，Abcam)；β-actin(ab8227)；GAPDH(ab8245)；cDNA逆转录试剂盒、SYBR荧光(日本Toyobo公司)。

1.2 实验仪器

荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；实时荧光定量PCR仪(美国罗氏公司)；梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)；凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；M5多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

1.3 细胞培养

GMCs细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中常规培养，待细胞融合度达到80%，接种于96孔板，进行如下分组：正常组(normal glucose group，NG，5.6 mM葡萄糖)；高糖组(high glucose group，HG，30 mM葡萄糖)；渗透压组(mannitol group，MA，30 mM甘露醇)；DPI(阳性药物组，10 μM DPI + 30 mM葡萄糖)；山奈酚药物组(5、10、20、40、80 μg/mL KAE + 30 mM葡萄糖)[9]。为了抑制AMPK/NOX4通路，使用compound C(10 μM)抑制AMPK表达。使用100 pmol的siNOX4、sip22phox瞬时转染GMCs，48 h后，Western blot检测沉默效率。

1.4 细胞毒性试验

将GMCs(5×103个/mL)接种于96孔板内，每孔加入100 μL含有不同浓度的KAE溶液(5、10、20、40、80 μg/mL)以及10 μM的DPI溶液，继续培养48 h。每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)避光培养4 h，弃去上清液，每孔加入100 μL的DMSO，脱色摇床振荡10 min，使底部甲瓒完全被DMSO溶解，用酶标仪在490 nm波长下测定各孔吸光度值。

二是在县农产品质量安全监督管理站建成农产品质量安全监管平台，重点生产基地、农产品批发市场设立检测室，对农产品质量、产地、用药情况等追踪溯源，实现从产前、产中、上市前全程受控，确保了全县产销农产品质量安全。

1.5 细胞增殖

将GMCs(5×103个/mL)接种于96孔板内，按照“1.3”进行细胞分组处理48 h，MTT法检测细胞增殖。

1.6 细胞内ROS测定

使用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平。将细胞接种于96孔或6孔板内，按照1.3进行细胞分组处理48 h，每孔加入10 μM DCFH-DA，避光培养30 min。PBS洗涤3次，在倒置荧光显微镜下观察荧光，酶标仪(λex= 488 nm，λem= 525 nm)测定荧光强度。

1.7 细胞内NOX、MDA、SOD活性测定

使用高灵敏度NADPH荧光定量测定试剂盒测定细胞内NOX活性。收集GMCs，1 000×g离心3 min。弃去上清，PBS洗涤2次。用200 μL预冷的NADPH提取缓冲液破碎细胞。冰上静置10 min，10 000×g离心5 min，以去除杂质。吸取上清与NADPH工作液混合，室温孵育60 min。用酶标仪(λex= 535 nm，λem= 587 nm)测定荧光强度。MDA和SOD抗氧化指标按相应说明书进行测定。每个实验重复三次。

1.8 RNA提取和实时定量PCR(qRT-PCR)分析

Trizol提取细胞总RNA，Toyobo高容量逆转录试剂盒反转录成cDNA。采用实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR分析，检测相关mRNA的表达。2-ΔΔCt方法计算并进行数据分析。GAPDH作为内参对照。引物序列如下：GAPDH，正向GTTACCAGGGC TGCCTTCTC和反向ACCAGCTTCCCATTCTCAG；NOX4，正向TGCATGGTGGTGGTATTGTTCCTC和反向AGCAGCAGCAGCATGTAGAAGAC；p22phox，正向CATGGAGCGGTGTGGACAGAAG和反向GCAGGCACGG ACAGCAGTAAG；TGF-β1，正向GCAACAATTCCTGGCGTTACCTTG和反向TGTATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC；Col IV，正向GATTGTGGTGGCT CTGGCTGTG和反向TCGTTCCAGGAAGTCCAGGTTCTC；Sestrin2，正向GACAACCTGGCGGTGGTGATG和反向CGTGTGCAGCAGCAGGTAGTG；AMPK，正向GACAACCTGGCGGTGGTGATG和反向CGTGTGCAGCAG CAGGTAGTG。

1.9 Western blot

收集GMCs，用含10% PMSF的RIPA裂解液进行裂解并提取蛋白。使用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。吸取样品30 μg加入到8%或12% SDS-PAGE凝胶中电泳，并用湿转法转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭膜1.5 h，TBST洗涤三次，在Sestrin2、AMPK、P-AMPK、NOX4、p22phox、TGF-β1、Col IV、β-Actin或GAPDH的特异性一抗中4 ℃孵育过夜。TBST洗涤三次，二抗室温孵育1 h，凝胶成像分析系统进行检测，Image J软件定量分析蛋白条带灰度值。β-Actin或GAPDH作为内参。

1.10 分子对接

Sestrin2(PDB ID：6N0M)和AMPK(PDB ID：4CFF)晶体结构从RCSB蛋白数据库下载，运用MOE软件进行对接研究。

1.11 统计分析

所有数据以Mean±SEM表示，采用单因素方差分析(ANOVA)分析多组间的显著性差异。数据统计分析使用GraphPad Prism软件进行。每个实验至少独立重复三次，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 山奈酚抑制HG诱导的GMCs细胞增殖

为了研究KAE对GMCs的作用，通过MTT法测定细胞增殖。如图1a所示，运用不同剂量的KAE(5、10、20和40 μg/mL)作用细胞48 h后，细胞活力没有明显变化，表明该剂量下KAE没有细胞毒性。基于此，我们选取浓度为5、10、20 μg/mL的KAE进行后续实验。在此基础上，研究KAE对HG诱导的GMCs增殖影响，结果如图1b显示。与低糖(NG)组相比，HG显著刺激细胞生长；KAE以浓度依赖性方式抑制细胞增殖；MA组中细胞增殖与低糖组相似，表明HG刺激细胞异常增殖，而不是由于渗透压升高所致。

图1 山奈酚(KAE)抑制高糖(HG)诱导的GMCs细胞增殖Fig.1 Kaempferol (KAE) attenuated high glucose (HG)-stimulated cell proliferation in GMCs注：(a)MTT法测定山奈酚对GMCs细胞毒性的影响；(b)MTT法测定山奈酚对高糖诱导的GMCs增殖的影响。与NG比较，#P < 0.05；与HG比较，*P < 0.05,**P < 0.01。Note:(a) The effects of KAE on the cytotoxicity of GMCs were assessed by MTT assay;(b) The effects of KAE on HG-induced GMCs proliferation were assessed by MTT assay.#P < 0.05 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.2 山奈酚抑制HG诱导的GMCs细胞内ROS的产生

为了研究HG刺激GMCs后细胞内ROS水平变化，使用DCFH-DA荧光探针作用细胞，荧光倒置显微镜下拍照观察，在λex = 488 nm，λem = 525 nm下用酶标仪测定荧光强度，结果如图2所示。与NG组相比，HG组内细胞绿色荧光更多更强，ROS产生明显增加(见图2a)；KAE作用24 h后ROS产生降低(图2a、b)，说明KAE能够清除细胞内ROS，具有一定抗氧化作用。

图2 山奈酚(KAE)抑制高糖(HG)诱导的GMCs细胞内ROS的生成Fig.2 KAE attenuated high glucose (HG)-stimulated ROS generation in GMCs注：(a)DCFH-DA荧光探针作用细胞，倒置荧光显微镜记录山奈酚对细胞内ROS产生的影响；(b)用酶标仪定量ROS水平。与NG比较，##P < 0.01；与HG比较，**P < 0.01。Note:(a) GMCs were treated with DCFH-DA fluorescent probe,and the effects of KAE on intracellular ROS production were recorded by inverted fluorescence microscopy;(b) The ROS level was quantified by microplate reader.##P < 0.01 vs NG;**P < 0.01 vs HG.

2.3 山奈酚对HG诱导的GMCs细胞内NOX、MDA、SOD影响

为了研究KAE抗氧化能力，使用试剂盒检测细胞内NOX、MDA、SOD水平变化，如图3a、b所示。与NG组相比，HG刺激细胞后，细胞内NOX活性、MDA含量明显增高；经过KAE处理后，显著抑制NOX和MDA活性。如图3c可知，在HG刺激下，细胞内SOD活性显著下降，KAE可以剂量依赖性方式增加SOD活性，表明KAE通过去除自由基而保护细胞免受氧化应激损害。

图3 山奈酚(KAE)对高糖(HG)诱导的GMCs细胞内NOX、MDA、SOD的影响Fig.3 Effects of kaempferol (KAE) on NOX,MDA and SOD in high glucose (HG)-stimulated GMCs注：山奈酚对高糖诱导的GMCs细胞内NOX(a)、MDA(b)、SOD(c)的影响。与NG比较，##P < 0.01；与HG比较，**P < 0.01。Note:Effects of KAE on NOX (a),MDA (b),SOD (c) in HG-induced GMCs.##P < 0.01 vs NG;**P < 0.01 vs HG.

2.4 山奈酚对HG诱导的GMCs细胞内ECM积聚影响

DN早期变化是GMCs肥大，这是由于高血糖早期阶段蛋白质合成增加所致。如图4a所示，HG组中细胞总蛋白与细胞数量的比率明显大于NG组；经KAE处理，细胞比率呈剂量依赖性下降。为了阐明KAE对ECM积累影响，利用qRT-PCR评估TGF-β1和Col IV的mRNA表达水平。如图4b、c所示，HG显著刺激GMCs中TGF-β1和Col IV mRNA表达；KAE处理后其表达水平下降。Western blot结果表明，KAE抑制HG刺激的GMCs中TGF-β1和Col IV蛋白水平表达(图4d～f)，表明KAE可以抑制HG诱导的细胞内ECM积聚。

图4 山奈酚(KAE)对高糖(HG)刺激的GMCs内ECM的影响Fig.4 Effect of kaempferol (KAE) on ECM accumulation in high glucose (HG)-induced GMCs注：(a)细胞总蛋白与细胞数量的比率表示为μg/105个细胞；(b、c)qRT-PCR分别检测KAE处理对TGF-β1和Col IV mRNA表达的影响；(d～f)Western blot分别检测KAE处理对TGF-β1和Col IV蛋白表达的影响。与NG比较，#P < 0.05，##P < 0.01；与HG比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(a) The ratio of total protein to cell number is expressed as μg/105 cells;(b,c) The mRNA effects of KAE treatment on TGF-β1,Col IV expression in HG-treated GMCs using qRT-PCR,respectively;(d-f) The protein effects of KAE treatment on TGF-β1,Col IV expression in HG-treated GMCs using Western blot,respectively.#P < 0.05,##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.5 山奈酚对HG诱导的GMCs细胞内NOX4和p22phox影响

NOX是一种酶复合物，可以促进ROS产生。由于NOX家族的蛋白亚型只有结合跨膜亚基(p22phox)形成活性复合物，才能发挥其生物学功能，所以我们通过qRT-PCR和Western blot分析检测KAE对NOX4和p22phox表达影响。结果表明：HG刺激GMCs中NOX4和p22phox的mRNA和蛋白水平表达，而KAE能够抑制NOX4和p22phox表达(图5a～d)。基于此，KAE可以通过抑制NOX家族蛋白亚型，发挥其抗氧化作用。

图5 山奈酚(KAE)对高糖(HG)诱导的GMCs内NOX4和p22phox表达的影响Fig.5 Effects of kaempferol (KAE) on NOX4 and p22phox expression in high glucose (HG)-induced GMCs注：(a、b)qRT-PCR和Western blot分别检测KAE对NOX4 mRNA和蛋白表达的影响；(c、d)qRT-PCR和Western blot分别检测KAE对p22phox mRNA和蛋白表达的影响。与NG比较，##P < 0.01；与HG比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(a,b) The mRNA and protein effects of KAE on NOX4 expression in HG-induced GMCs using qRT-PCR and Western blot,respectively;(c,d) The mRNA and protein effects of KAE on p22phox expression in HG-induced GMCs using qRT-PCR and Western blot,respectively.##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.6 山奈酚对HG诱导的GMCs中Sestrin2/AMPK通路影响

为了进一步探究KAE作用的分子机制，我们使用qRT-PCR和Western blot方法确认Sestrin2/AMPK通路的潜在参与。由图6a～d可知，与NG组相比，HG刺激抑制Sestrin2和P-AMPK表达；加入KAE后，Sestrin2和P-AMPK表达显著升高，表明KAE可以能通过激活Sestrin2/AMPK通路发挥抗氧化作用。

图6 山奈酚(KAE)对高糖(HG)诱导的GMCs细胞内Sestrin2和AMPK表达的影响Fig.6 Effects of kaempferol (KAE) on Sestrin2 and AMPK expression in high glucose (HG)-induced GMCs注：(a、b)qRT-PCR和Western blot分别检测KAE对Sestrin2 mRNA和蛋白表达的影响；(c、d)qRT-PCR和Western blot分别检测KAE对AMPK mRNA和蛋白表达的影响。与NG比较，#P < 0.05,##P < 0.01；与HG比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(a,b) The mRNA and protein effects of KAE on Sestrin2 expression in HG-induced GMCs using qRT-PCR and Western blot,respectively;(c,d) The mRNA and protein effects of KAE on AMPK expression in HG-induced GMCs using qRT-PCR and Western blot,respectively.##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.7 siNOX4和sip22phox抑制HG诱导的GMCs中ROS和ECM积聚

为了探究NOX4/p22phox在分子机制中作用，我们利用siNOX4和sip22phox小干扰RNA，将HG诱导的GMCs中NOX4和p22phox沉默。首先，利用Western blot检测基因沉默效果，与NC、NT相比，siRNA降低NOX4和p22phox表达(见图7a～c)。其次，检测在HG存在下，siNOX4和sip22phox对细胞内ROS水平影响，如图7d、e所示，与HG组相比，siNOX4和sip22phox明显抑制ROS产生。由图7f～i可知，siNOX4和sip22phox降低了TGF-β1和Col IV蛋白表达水平，说明激活HG诱导的ROS和ECM积累，可能由于NOX4/p22phox信号介导引起。

图7 siNOX4和sip22phox对高糖(HG)诱导的GMCs细胞内ROS和ECM积累的影响Fig.7 Effects of siNOX4 and sip22phox on intracellular ROS and ECM accumulation in high glucose (HG)-induced GMCs注：(a～c)用非靶向siRNA(NT)、siNOX4和sip22phox转染GMCs,Western blot检测NOX4和p22phox的蛋白表达水平；(d)DCFH-DA荧光探针作用细胞，倒置荧光显微镜记录山奈酚对细胞内ROS产生的影响；(e)用酶标仪定量ROS水平；(f～i)Western blot检测TGF-β1(f、h)和Col IV(g、i)的蛋白表达水平。与NG比较，#P < 0.05，##P < 0.01；与HG比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(a-c) GMCs were transfected with nontargeting siRNA (NT),siNOX4,sip22phox,and then the protein expression levels of NOX4 and p22phox were determined by Western blot;(d) GMCs were treated with DCFH-DA fluorescent probe,and the effects of KAE on intracellular ROS production were recorded by inverted fluorescence microscopy;(e) The ROS level was quantified by microplate reader;(f-i) The factors of TGF-β1 (f,h) and Col IV (g,i) were examined by Western blot.#P < 0.05,##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.8 Compound C逆转山奈酚对HG诱导的GMCs保护作用

考虑到AMPK参与KAE对HG诱导的GMCs作用，我们使用Compound C抑制AMPK表达。结果表明：Compound C逆转KAE对HG诱导的GMCs细胞增殖、OS和ECM积聚的保护作用 (见图8 a～g)。为了进一步阐明KAE是否能直接结合Sestrin2/AMPK的活性位点，采用分子对接方法研究Sestrin2与AMPK的相互作用。KAE与Sestrin2的Glu-E451、Ser-E450、Thr-E377、Tyr-E375、Thr-E374、Thr-E386形成氢键对接，与His-E454形成苯环对接(见图8h)。KAE可与AMPK的Glu-E274、Pro-A367、Lys-E170、Arg-E299和残基Arg-E269形成5个强氢键，与Arg-E269形成苯环对接(见图8i)。基于以上分析，KAE可能通过激活Sestrin2/AMPK通路发挥抗氧化作用。

图8 Compound C逆转了山奈酚(KAE)在GMCs中对高糖(HG)诱导的细胞增殖、OS和ECM积累的保护作用Fig.8 Compound C reversed the protective effects of KAE against high glucose (HG)-induced cell proliferation,OS and ECM accumulation in GMCs注：(b)MTT法检测细胞增殖；(c)用酶标仪测定ROS水平；(a、d～g)用Western blot检测AMPK(d)、NOX4(e)、TGF-β1(f)、Col IV(g)蛋白水平；(h、i)采用分子对接方法研究了KAE与Sestrin2/AMPK的相互作用。与NG比较，##P < 0.01；与HG比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(b) The cell proliferation was assessed by MTT assay;(c) The ROS level was quantified by microplate reader;(a,d-g) The protein levels of AMPK (d),NOX4 (e),TGF-β1 (f),and Col IV (g) were determined by Western blot;(h,i) Molecular docking methods were used to study the interaction between KAE and Sestrin2/AMPK.##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

3 讨论与结论

血糖水平升高被认为是糖尿病肾病肾功能和病理改变的关键因素[10]。由于在HG环境下培养的系膜细胞表型与DN患者相似[11]，故在本实验中，我们研究KAE在体外对HG诱导的GMCs损伤保护作用，结果表明KAE通过调节AMPK/NOX4途径抑制HG诱导的GMCs细胞增殖，OS和ECM积累。

DN早期特征是系膜细胞异常增殖和ECM过度沉积，通常导致肾小球系膜增生，肾纤维化和终末期肾损害[3]。胶原蛋白、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白是ECM的主要成分，其主要是在高血糖刺激下合成[12]。在DN中，TGF-β1是参与肾脏ECM积累的关键细胞因子[13]。在正常生理状况下，机体多种细胞可以分泌不活跃状态的TGF-β1；在高糖环境下，不活跃状态的TGF-β1可以转化为活跃状态，通过增加ECM基因(如Col IV)表达和减少ECM降解，促进肾小球ECM积累[13]。抑制TGF-β1能够减弱高糖诱导的ECM基因表达变化，从而减少DN中ECM积累[14]。结果表明，在高糖刺激的GMCs细胞中，TGF-β1、Col IV的mRNA和蛋白水平表达明显升高，而KAE处理后可以降低其表达，表明KAE可以通过降低ECM积累和促进其降解来发挥抗糖尿病作用。

DN发病机制与OS发生有关，可以激活细胞内多种信号通路并刺激转录因子，从而导致ECM积累增加并减少基质降解。HG诱导的ROS生成，会破坏氧化剂和抗氧化剂之间平衡，干扰抗氧化剂防御系统，从而导致GMCs受损。基于此，ROS的过量产生在DN发病机理中起到重要作用。在病理条件下，ROS清除需要酶和非酶系统的共同参与，例如SOD和MDA[15]。SOD是一种抗氧化剂金属酶，通过催化超氧阴离子和过氧化氢歧化，在维持氧化和抗氧化之间平衡中发挥重要作用[16]。MDA对抗氧化剂防御系统有影响，因为MDA水平与GMCs中膜脂质过氧化水平直接相关[16]。结果显示，KAE可能增加HG诱导的GMCs中SOD活性并降低MDA含量，表明KAE具有潜在的抗氧化特性。

ROS转导和葡萄糖信号增强被认为是促进DN发展的重要致病因素。肾脏内ROS有多种来源，其中NOX家族的NADPH氧化酶亚型主要与糖尿病肾病有关[3]。迄今为止，研究发现NOX家族有七个亚型，其中NOX4在大鼠和小鼠肾小球、足细胞和肾小管细胞中大量表达。通常情况下，NOX4和跨膜亚基(p22phox)结合形成活性复合物，才会发挥其生物学功能[17]。NOX4上调与暴露于HG的系膜细胞和管状细胞中FN和TGF-β1升高有关[18]。NOX4与成纤维细胞中TGF-β1诱导的ECM积累有关，有助于其分化为纤维化的成纤维细胞表型。NOX4被证明介导血管紧张素Ⅱ治疗下的系膜肥大的增加，以及FN升高[19]。过多OS和ECM积聚可能导致肾损伤，并被认为是DN发生的重要原因。为了探讨OS、ECM积聚和NOX之间关系，使用Western blot和qRT-PCR实验DN中高表达的NOX4亚型的蛋白和mRNA水平。研究表明，消除NOX4活性会导致HG诱导的GMCs中OS和ECM降低[24]。本实验结果与之前研究一致，HG通过上调NOX4和p22phox的mRNA和蛋白表达，刺激GMCs中ROS、TGF-β1和Col IV生成[20]。使用KAE以及沉默NOX4和p22phox，可以抑制OS和ECM积累，表明KAE发挥抗氧化作用是通过NOX4/p22phox途径调控。

Sestrins家庭是由一组参与细胞内稳定性调节的压力诱导蛋白组成，是抗氧化防御机制之一，具有两种不同的生物学活性功能。首先，通过抑制ROS积累发挥抗氧化剂作用[7]，可能涉及抗氧化剂转录因子调节。其次，Sestrins通过激活AMPK或抑制Rag GTPases充当mTORC1的反馈抑制剂[5]。AMPK是一种重要的代谢传感器，在几乎所有真核细胞中广泛表达[4]。研究表明，在HG条件下，Sestrin2和AMPK激活抑制GMCs中NOX4诱导的ROS积累[6]。AMPK磷酸化抑制人系膜细胞中ROS产生和ECM积累[14]。此外，AMPK磷酸化可以抑制TGF-β1在尿液中积累，抑制系膜基质扩张，减少DN小鼠模型中胶原沉积[21]。越来越多研究认为AMPK与DN中NOX活性密切相关。在本实验中，我们发现KAE通过上调AMPK显著抑制HG诱导的细胞增殖、ROS产生、NOX4、TGF-β1和Col IV表达。此外，compound C逆转KAE对HG诱导的OS保护作用和ECM在GMCs中沉积。

综上所述，本研究证明KAE通过调节AMPK/NOX4通路，对HG诱导的GMCs OS和ECM积累发挥保护作用，期望KAE可以作为防治DN的潜在候选药物或先导化合物。