一种马勃属野生真菌分离鉴定及生物学特性研究

摘要 采用形态鉴定与ITS分子序列鉴定相结合的方法，对采集的一株马勃属野生真菌进行鉴定，并对该菌种菌丝生物学特性进行研究。结果表明，初步通过形态鉴定法鉴定为梨形马勃，后进一步用ITS分子序列鉴定法鉴定，分离株rDNA ITS 片段长度为697 bp，测序结果登录NCBI与GenBank中已知菌种进行BLAST比对，采用MEGA 2.0软件构建系统发育树，鉴定分离菌种为网纹马勃，结合形态特征，最终鉴定该菌种为网纹马勃（Lycoperdon perlatum）。生物学特性研究结果表明，可溶性淀粉为该菌丝生长的最适碳源，硝酸铵为最适氮源，7.0为最适pH，菌丝最适温度为25 ℃。

关键词 网纹马勃;分离;鉴定;生物学特性

中图分类号 S-646  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）13-0120-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.029

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Identification and Biological Characteristics of a Wild Lycoperdon perlatum

ZHANG Yan

（Liaoning Provincial Institute of Poplar， Gaizhou， Liaoning 115213）

Abstract A wild macrofungi fruiting body was isolated by tissue isolation method， identified by morphological identification and its molecular sequence identification， and the biological characteristics of the mycelium were studied. The results showed that the strain was identified as Lycoperdon pyriforme Schaeff.：Pers by morphological identification and ITS molecular sequence identification. The length of ITS fragment of rDNA was 697 bp. The sequencing results were registered in NCBI and compared with the known strains in GenBank by blast， the ITS sequence with similar height was downloaded and compared with cluster W. Mega 2.0 software was used to construct the system tree， and the isolated strain was identified as Lycoperdon perlatum. The results showed that the suitable carbon source for mycelium growth was soluble starch， the suitable nitrogen source was ammonium nitrate， the suitable pH value was 7.0， and the optimum temperature was 25 ℃.

Key words Lycoperdon perlatum;Isolation;Identification;Biological characteristics

網纹马勃（Lycoperdon perlatum），马勃菌目马勃菌科马勃属。夏秋季林中常见，幼时可食，子实体有消肿、止血、解毒作用。可与松树、栎树、云杉等形成外生菌根，具有良好的经济价值和生态价值，有必要开展深入研究。笔者对该野生菌种进行了鉴定，并初步研究其生物学特性，旨在为其进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

该林场距哈尔滨市108 km，地处127°30′～127°34′E，45°20′～45°25′N，年平均气温2.6 ℃，最低温度在1月，为-31.9 ℃，最高温度在7月，为32 ℃。年均降水量723.8 mm，多集中在7、8月，占全年总降水量的54%，蒸发量1 093.3 mm，无霜期120～140 d，年日照时数2 471.3 h，春季有很强的西南、西北气流侵入，少雨干旱。该地区地带性土壤为暗棕壤，有机质含量较为丰富。

1.2 试验材料

1.2.1 子实体。子实体采自东北林业大学帽儿山试验林场（图1）。

1.2.2 培养基。

菌种分离及扩繁采用PDA加富培养基。

1.2.3 主要试剂及引物。

选用TIANGEN-DNA secure-新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司），引物ITS1/ITS4（宝生物工程有限公司）[1]。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种分离。

将球状子实体表面用75%乙醇棉轻轻擦拭干净，放入超净工作台上，在菇柄处用手术刀切开0.5 cm深，用手轻轻掰开，从露出的新鲜菌肉处切取米粒大小的菌肉接入培养基。然后于25 ℃暗培养，标记为LXMB。记录分离成功率、菌丝块萌发时间、菌丝颜色、密度、长势[2]。

1.3.2 菌种鉴定。

1.3.2.1 形态鉴定法。

对照图谱等工具书，观察子实体的形状、颜色等形态特征，进行初步鉴定。

1.3.2.2 分子鉴定法。

刮取新鲜菌丝，使用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒进行基因組DNA提取，并将提取的DNA溶于25 μL TE（pH 8.0）中，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

以提取DNA为模板，应用真菌通用引物对ITS1和ITS4进行PCR扩增，采用张妍等[2]的反应体系及反应程序进行。将PCR产物用凝胶成像系统检测拍照，依据条带清晰情况，确定是否进行进一步测序。

将测得的序列输入GenBank进行BLAST比对，比对出最为相似的已有序列，节选比对出相似序列的ITS区域，用Clustalw（BioEdit 7.0软件）进行多序列比对。将比对结果输入MEGA 5.2软件，采用N-J法构建测得序列的系统发育树，进行系统发育分析[3]。

1.3.3 生物学特性分析。

开展不同碳源、氮源、pH、温度4个单因素试验（表1），每处理5次重复，培养30 d后，测量菌丝直径，同时观察菌丝长势、浓密度、色泽等生长指标。

2 结果与分析

2.1 分离结果

分离第2天可见菌块上长出白色绒毛状菌丝，菌丝生长初期颜色洁白、菌丝整齐，待菌丝快要长满培养皿时，菌丝较密，边缘整齐，有束状菌丝（图2、3）。 在分离过程中，污染情况发生较少，可见组织分离是该菌种适宜的分离方法。菌丝平均生长速度为0.148 cm/d，长速较慢。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态鉴定。

子实体小，高2.0～3.5 cm，梨形至近球形，不孕基部发达，由白色菌丝束固定于基物上。初期包被色淡，后呈茶褐色至浅烟色，外包被形成微细颗粒状小疣，内部橄榄色，后变为褐色。孢子橄榄色，平滑，球形，直径3.5～4.5 μm。初步鉴定为梨形马勃（Lycoperdon pyriforme Schaeff.：Pers）[4-5]。

2.2.2 分子鉴定。

2.2.2.1 菌丝总DNA 提取及琼脂糖凝胶电泳检测。

提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测发现，DNA样品条带有降解现象（图4），尝试作为PCR反应模板进行PCR扩增。

2.2.2.2 PCR扩增。

经凝胶成像检测扩增产物发现，成功扩增出了目的条带，且条带整齐明亮（图5），目的片段大小在700 bp左右，可以进行测序。

2.2.2.3 内转录间隔区（ITS）序列。

序列测定结果显示，其PCR扩增产物长度为碱基697 bp，登录NCBI经Blast比对测序，结果表明，与LXMB相似性最高的菌株序列号分别为AB669511.1、FM999681.1、DQ112630.1、DQ421095.1、FM999608.1，菌种名称分别为Uncultured ectomycorrhizal fungus（不能培养的外生菌根真菌）、Uncultured fungus、Lycoperdon perlatum（网纹灰包）、Uncultured soil fungus、Uncultured fungus，Query cover分别为99%、100%、99%、99%、99%，ident均为99%。排名靠前的多为不能培养的外生菌根真菌，只有一个给出种名的为网纹灰包及网纹马勃，根据第5位往后的比对结果，菌种名绝大多数为Lycoperdon perlatum（网纹灰包），下载相似高的29个ITS序列，用ClustalW进行序列比对，用MEGA 5.2软件构建系统树，分析序列采用 Ki mura双参数模型。EU 780685.1为外类群（outgroup），从中间生根（The tree ism idpoint rooted）。图6只显示用百分数表示的大于50%的Bootstrap值，从图6可看出，MB与所有的Lycoperdon perlatum序列聚为一支，亲缘关系较近，因此将MB形态学鉴定的梨形马勃更正为网纹马勃。

经形态鉴定与分子鉴定综合分析，最终鉴定该菌种为网纹马勃（Lycoperdon perlatum），属担子菌亚门（Basidiomycotina）腹隔担子菌纲（Gasteromycetes）马勃目（Lycoperdales）马勃科（Lycoperdaceae）马勃属（Lycoperdon）。

2.3 菌丝生物学特性

2.3.1 不同碳源对网纹马勃菌丝生长的影响。

由表2可知，不同碳源对网纹马勃菌丝生长的影响差异极显著。可溶性淀粉作碳源时，菌丝生长速度最快，且较为健壮浓密。但加入果糖的菌丝长势最旺，在6个处理中最为浓密。可见，综合可溶性淀粉与果糖作为碳源最有利于网纹马勃菌丝生长。

2.3.2 不同氮源对网纹马勃菌丝生长的影响。

由表3可知，4种氮源处理间差异极显著。硝酸铵作为氮源时，菌丝生长速度最快、健壮、浓密，是网纹马勃菌丝生长的最佳氮源。

2.3.3 不同pH对网纹马勃菌丝生长的影响。

由表4可知，不同pH对网纹马勃菌丝生长的影响差异极显著。当pH为7.0时，菌丝生长速度最快、最浓密;当pH为6.0、6.5、7.5时，菌丝生长速度及长势均为中等;当pH为5.5时，菌丝生长速度最慢，长势弱且稀。可见，pH为7.0时最适合网纹马勃菌丝生长。

2.3.4 不同温度对网纹马勃菌丝生长的影响。

由表5可知，不同温度处理差异极显著，网纹马勃菌丝在25 ℃时生长最快，30 ℃次之，15～30 ℃时均可生长。

3 结论与讨论

3.1 菌种鉴定

该研究最初采用形态鉴定法鉴定菌种为梨形马勃，但对于难以人工成功培养子实体的菌根菌，单纯的形态鉴定法不够准确。近年来，形态鉴定辅以ITS序列分子鉴定，已被广大研究人员广泛应用于大型真菌鉴定[6-11]。因此，进一步采用ITS序列分子鉴定法，将菌种进一步修正为网纹马勃，可见ITS序列分子鉴定法结合形态鉴定对于鉴定难以人工培养成功子实体的菌根菌是非常有必要的。

3.2 生物学特性

该研究利用碳源、氮源、pH、温度单因素试验初步确定了网纹马勃菌丝生长最适宜生长条件。但总体来说，外生菌根真菌菌丝生长速度仍较慢，还需要在该试验的基础上，进一步探索影响菌丝生长的其他因素，以及各因素之间是否存在交互作用，进而优选出最优培养方式。

參考文献

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