葡萄籽多酚对免疫抑制小鼠肠道菌群的影响

王 伟，布丽根·加冷别克，祖丽普努尔·麦提赛伊迪，娜迪热·阿卜杜克热木，游义琳，胡晓东

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

人体肠道（肠黏液、肠腔、粪便）中栖居着众多的肠道微生物，总数可达1013～1014个，在肠道中形成一个复杂互作的菌群生态系统。肠道菌群编码的基因可达人体自身基因的100倍左右[1]，在肠道菌群结构稳定及肠道微生态平衡的状态下，肠道菌群及其代谢产物对于机体物质能量代谢、提高机体免疫力、协助机体抗感染等生理调节作用的发挥具有十分重要的意义[2]。植物多酚是一类多羟基化合物，是广泛存在于茶叶、葡萄、苹果、酒类及多种水果和蔬菜中的具有多元酚结构的次生代谢物[3]。研究发现，植物多酚不仅具有抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等生物活性[4]，还能调节宿主肠道菌群结构，调控肠道菌群的代谢通路，刺激乙酸、丙酸及丁酸等短链脂肪酸（SCFAs）的产生[5]，这些SCFAs可以被肠道黏膜吸收，给予结肠肠壁细胞能源，对肠道健康起重要作用，同时还可以降低肠道pH，抑制一些致病菌的生长[6]。

我国葡萄种植面积广、产量高，据统计，约80%的葡萄被用来酿酒[7]。葡萄酒在加工过程中，一般会产生20%～25%左右的葡萄籽等废弃物[8]，但其综合利用水平仍有待提高。葡萄籽多酚是葡萄籽等废弃物中的主要功能性成分之一，被认为是一种天然的强效抗氧化剂[9]。此外，大量动物试验表明葡萄籽多酚可以调节肠道活动，改变肠道菌群的结构和功能，例如：Collins等[10]发现葡萄籽多酚不仅可以增加肥胖小鼠的胰岛素抗性，还能提升肠道中毛螺菌属（Lachnospiraceae）的丰度；Choy等[11]研究发现，葡萄籽多酚能够增加雌猪肠道中毛螺菌属（Lachnospiraceae）、梭菌属（Clostridiales）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的丰度。鉴于目前国内外研究主要集中在葡萄籽多酚的抗氧化功效上，而有关葡萄籽多酚的免疫调节活性及其对免疫抑制小鼠肠道菌群的影响尚未进行充分的研究。因此，本研究采用环磷酰胺（Cyclophosphamide，CPA）诱导建立小鼠免疫抑制模型，通过Illumina MiSeq高通量测序平台对小鼠粪便样本中细菌16SrDNA V3-V4区进行分析，解析免疫抑制小鼠肠道菌群的变化，以期为葡萄籽多酚在预防、治疗、提高机体免疫力及临床应用等多方面提供有效的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

脱脂赤霞珠葡萄籽粉，由新疆天裕葡萄酒业有限公司赠送；清洁级BALB/c小鼠，雌性，质量18～22 g，由新疆医科大学实验动物中心提供（合格证号0030557）。

免疫球蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所；粪便基因组DNA提取试剂盒：美国Omega Bio-Tek公司；琼脂糖，福林酚试剂：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸标准品：美国Sigma公司；环磷酰胺：美国Sigma-Aldrich公司；SCFAs标准品（乙酸、丙酸及丁酸）：北京中科质检生物有限公司。

1.1.2 仪器与设备

79-3型恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器厂；XP2001S精密天平：梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2D双人净化工作台：上海苏净实业有限公司；GRP-9160型隔水式恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；UV-5200型紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；OSB-2100型真空旋转蒸发仪：日本EYELA公司；Centrufuge5415R型高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；FE-20型pH计：瑞士梅特勒-托利多公司；MiSeq测序仪：美国Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽多酚的制备

参照仇菊等[12]的方法，称取1.0 g脱脂葡萄籽粉样品，加60%乙醇20 mL，避光置于80℃水浴中提取2 h，6 000 r/min离心10 min取上清液，40℃旋蒸浓缩至原体积1/6后，置于-40℃真空冻干48 h得到葡萄籽多酚提取物。

1.2.2 葡萄籽多酚含量的测定

参考Chu等[13]的方法，准确称取0.01 g葡萄籽多酚提取物，用0.4 mL的60%乙醇溶解，加入0.4 mol/L的福林酚试剂0.1 mL，混合均匀，30℃避光反应5 min后加入7%的碳酸钠溶液1 mL，再用蒸馏水定容至2.5 mL，避光反应60 min后，用紫外可见分光光度计在747 nm处测定吸光值。

同时以没食子酸为标准品绘制标准曲线（标准没食子酸浓度为0.01～0.1 mg/mL），以吸光值为纵坐标，以标准没食子酸溶液浓度为横坐标，得到回归方程：y=0.096 8x-0.013 4，R2=0.998 5。葡萄籽多酚提取物中总酚含量用没食子酸当量（Gallic acid equivalent，GAE）μg GAE/mg DW表示。

1.2.3 动物分组处理

参照孔妮等[14]的方法，将40只清洁级BALB/c小鼠适应性饲养2 d后，随机分为4组，每组10只，分别作为空白对照组，模型对照组、葡萄籽多酚提取物（多酚含量为40μg GAE/mg DW）低剂量组及高剂量组。除空白对照组外，其余各组连续3 d腹腔注射CPA（80 mg/（kg·d）），建立免疫缺陷小鼠模型；随后，葡萄籽多酚提取物给药组每天灌胃给药，根据前期预试验的结果，确定葡萄籽多酚提取物低、高剂量组的给药量分别为50、150 mg/（kg·d），灌胃量均为0.3 mL/只，空白对照组和模型对照组每天灌胃等体积的生理盐水，连续14 d。

1.2.4 免疫器官指数的测定

参照甘霓等[15]的方法，不同处理组的BALB/c小鼠末次灌胃给药12 h后，采用乙醚麻醉后颈椎脱臼法处死，取脾脏及胸腺，计算脏器指数，脏器指数（mg/g）=脏器质量（mg）/体重（g）。

1.2.5 免疫球蛋白含量分析

参照孔妮等[14]和文艳巧等[16]的方法，于试验结束时，小鼠摘眼球采血，收集血液于Eppendorf管中室温静置4 h后，置于4℃冰箱过夜，4 000 r/min离心15 min收集血清，采用ELISA法按照试剂盒说明书进行IgG、IgM的检测；同时从距盲肠3 cm处剪取结肠1.5 cm，平铺于滤纸上，纵向切开，暴露黏膜面，刮取肠黏液，收集于Eppendorf管中，再加入含0.1%蛋白酶抑制剂的0.01 mol/L冰浴磷酸盐缓冲液1 mL，充分混匀，3 000 r/min离心15 min取上清液，采用ELISA法按照试剂盒说明进行sIgA检测。

1.2.6 小鼠粪便的收集

小鼠灌胃给药试验结束后，无菌称取小鼠结肠末端成形新鲜粪便0.3 g左右迅速置于-80℃超低温冰箱，待分析用。

1.2.7 小鼠粪便DNA的提取

小鼠粪便DNA利用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.8 小鼠肠道微生物16SrDNA高通量测序

参照文献[17-18]，利用Illumina MiSeq高通量测序平台对提取的小鼠粪便微生物DNA进行高通量测序。采用细菌16SrDNA V3-V4扩增通用引物，测序引物为338F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），不同样本在引物5’端加入6 bp条码序列用于区分样品。

1.2.9 高通量测序数据分析处理

MiSeq测序数据使用TrimGalore、FLASH2及Mothur软件进行质控拼接并去除低质量碱基[19-20]，利用USearch软件得到质量和可信度较高的优化序列，该数据用于后续生物信息分析。运算分类单位（Operationaltaxonomicunit，OTU）聚类分析通过在QIIME中调用Uclust方法对优质序列按相似度0.97进行聚类[21]，选取每个类最长的序列为代表序列。OTU注释通过在QIIME中采用BLAST的方法对序列数据库进行比对[22]，获得每个OTU分类学信息，利用R软件生成样本间（或组间）OTU的维恩图。根据OTU列表中的各样品物种丰度情况，应用Mothur软件计算生物多样性指数，并将优势菌门（属）与短链脂肪酸（SCFAs）结合制成冗余分析图。

1.2.10 盲肠内容物SCFAs含量的测定

参照Alfa等[23]的方法，盲肠内容物称重后溶于1 mL去离子水中，充分振荡混匀，12 000 r/min离心5 min，取上清，经0.22μm水相滤膜过滤，用于气相色谱检测。检测条件：SH-Rtx-5柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），载气氮气，总流速140 mL/min，进样口温度280℃，FID检测器300℃，不分流；采用程序升温：初始温度80℃，以3℃/min升温至150℃，然后以20℃/min升温至250℃保持2 min；进样量1μL。

1.2.11 数据处理

所有数据均以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 20.0统计软件的单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄籽多酚对小鼠免疫器官指数的影响

胸腺和脾脏是机体主要的免疫器官，免疫器官指数的改变是评价机体免疫能力状况的关键指标[24]。葡萄籽多酚对小鼠免疫器官指数的影响如表1所示。

表1 葡萄籽多酚对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响Table1 Effects of grapeseed polyphenol on immune organs indexes of immunosuppressed mice 单位：mg/g

由表1可知：模型对照组小鼠胸腺指数和脾脏指数均显著低于空白对照组（P＜0.05），说明小鼠免疫抑制模型造模成功；与模型对照组相比，葡萄籽多酚对BALB/c小鼠进行干预后，小鼠的胸腺指数、脾脏指数均显著增加（P＜0.05），说明葡萄籽多酚可以在一定程度上保护小鼠的免疫器官，增强小鼠的免疫活性。

2.2 葡萄籽多酚对小鼠免疫球蛋白的影响

免疫球蛋白是免疫系统的有机组成部分，在体液免疫中发挥着重要作用。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，IgA是血清中含量仅次于IgG的免疫球蛋白，对机体局部黏膜免疫起到非常重要的作用，特别是对经黏膜途径感染的病原微生物具有抵抗作用[25]，sIgA是消化道黏膜免疫最显著的效应分子，可在肠黏膜表面形成有效的防御屏障[26]。葡萄籽多酚对小鼠免疫球蛋白的影响如表2所示。

表2 葡萄籽多酚对免疫抑制小鼠免疫球蛋白的影响Table 2 Effects of grape seed polyphenol on immunoglobulin of immunosuppressed mice 单位：μg/mL

由表2可知：与空白对照组相比，模型对照组小鼠免疫球蛋白含量（sIgA、IgM、IgG）显著降低（P＜0.05），说明模型对照组小鼠体内特异性抗体分泌较少，免疫功能受到限制；与模型对照组相比，葡萄籽多酚干预能够增加小鼠免疫球蛋白含量（P＜0.05），与De Leblanc等[27]的研究结果一致，推测葡萄籽多酚能够刺激机体产生更多抗体，引起小鼠机体的特异性体液免疫应答，激发特异性抗体的大量产生，从而增强小鼠的免疫功能。

2.3 肠道菌群Alpha多样性分析

α多样性反映的是样品菌群丰度及菌群多样性，有多种衡量指标[28]。Chao1和ACE指数用来估计菌群丰度即菌群数量的多少，Shannon和Simpson指数用来估计样本中菌群的多样性，Coverage指各样本文库的覆盖率[29]。由图1可知，与模型对照组相比，低剂量葡萄籽多酚提取物样品组中肠道菌群的数量最多（Chaol值469.09、ACE值459.45、Shannon值3.99、Simpson值0.04、Coverage值0.999 7）。这种现象可能是由于高剂量葡萄籽多酚提取物样品组中的黄烷醇单体含量高于低剂量葡萄籽多酚提取物样品组，而黄烷醇单体能够与肽聚糖结合，破坏微生物细胞膜结构，具有抑菌作用[30-31]。

图1 小鼠肠道菌群的OTU数量及Alpha多样性Fig.1 OTUnumber and Alpha diversity of gut microbiota in mice

2.4 肠道菌群Beta多样性分析

不同分组间的样本存在一定的特性和共性，Venn图[32]可以筛选每组样本中特有的OTU以及组间共有的OTU。不同样品组中群落Venn图见图2。

图2 不同小鼠肠道菌群Venn图Fig.2 Venn diagram of intestinal florain different mice

由图2可知：空白对照组小鼠肠道菌群共得到499个OTU，模型对照组中肠道菌群共得到432个OTU，样品低剂量组共得到561个OUT，样品高剂量组中肠道菌群共得到457个OUT；其中空白对照组中特有肠道菌群的OTU为11个，模型对照组中特有肠道菌群的OTU为3个，样品低剂量组中特有肠道菌群的OTU为72个，样品高剂量组中特有肠道菌群的OTU为5个。由OTU数目分布Venn图可以进一步得出，葡萄籽多酚低剂量组微生物丰度最高，对于小鼠肠道菌群具有调节作用。

2.5 菌群构成分析

不同样品对小鼠肠道菌群构成的影响如图3A和图3B所示。

图3 门水平（A）及属水平（B）的小鼠肠道菌群相对丰度柱状图Fig.3 Relativeabundance of phylum(A)and genus(B)levels of gut microbiota in mice

由图3A可知：在门水平，除去未确定类群的肠道菌，主要由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝藻门（Cyanobacteria/Chloroplast）、软壁菌门（Tenericutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）及浮霉菌门（Planctomycetes）组成；其中变形菌门主要包含沙门氏菌（Salmonella）等致病菌[33]，与模型对照组相比，葡萄籽多酚提取物低剂量样品组中变形菌门相对丰度最低，约为模型对照组数量的8.14%，表明葡萄籽多酚提取物在小鼠肠道菌群的作用下产生的代谢产物抑制了变形菌门的生长繁殖；同时对各组样品中厚壁菌门与拟杆菌门的相对丰度进行分析发现，葡萄籽多酚低剂量组小鼠肠道中F/B值（F：厚壁菌门丰度值；B：拟杆菌门丰度值）较模型对照组显著增加（P＜0.05），F/B值由1.34增加到3.13，这与訾雨歌等[34]的研究结果相似，表明低剂量葡萄籽多酚干预可以显著调整肠道菌群的结构组成。

肠道菌群微生态失衡会引起人体出现免疫性疾病、代谢性疾病和消化性疾病[35]。植物多酚对维持肠道微环境的稳态有较大作用[36]。研究表明，植物多酚类物质可以抑制肠道内有害菌群的生长繁殖，促进有益菌如乳酸杆菌、双歧杆菌等的生长[37]。由图3B可知：与模型对照组相比，葡萄籽多酚提取物干预显著降低了巴恩斯氏菌属（Barnesiella）、埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia/Shigella）、艾克曼菌属（Akkermansia）的相对丰度，且葡萄籽多酚提取物低剂量组中埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia/Shigella）的相对丰度仅为模型对照组的2.54%。Jensen等[38]研究发现，埃希氏菌属、颤螺菌属、梭菌属和瘤胃球菌属可能会增加炎症发生的风险。同时，葡萄籽多酚提取物干预能够显著增加乳酸杆菌属（Lactobacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）、狄氏副拟杆菌属（Parabacteroides distasonis）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）、坦纳拟普雷沃菌属（Alloprevotella tannerae）、别样棒菌属（Allobaculum）、罗姆布茨菌属（Romboutsia）的相对丰度，且葡萄籽多酚提取物低剂量组中乳酸杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）的相对丰度是模型对照组的1.38倍和56.72倍。Ejtahed等[39]研究发现，乳酸杆菌属和双歧杆菌属等益生菌具有显著的益生效果，包括抑制致病菌、改善肠道菌群结构、增强机体免疫功能等功效。Ren等[40]研究发现，乳酸菌属和双歧杆菌属等肠道益生菌属，其数量与机体免疫能力在一定程度上呈正相关。Hua等[41]研究亦证明，乳酸杆菌属和双歧杆菌属等益生菌能够刺激机体免疫功能，上调抗炎细胞因子，抑制机体炎症反应，其代谢产物还能促进肠上皮细胞的修复和再生，从而有效减少脂多糖的吸收。此外，Nami等[42]发现，乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌有利于调节肠道杯状细胞的功能和促进肠上皮释放IgA和防御素等，同时二者有助于改善免疫系统应答、抑制病原菌的定植以及增强肠道上皮屏障[43]。

2.6 小鼠盲肠中短链脂肪酸含量的测定结果

膳食多酚类物质可能引起某些特定肠道微生物的数量变化，而肠道微生物也会影响多酚类物质的转化途径和过程，如短链脂肪酸的产生[44]，乙酸、丙酸与丁酸在肠道中的含量最高，是肠道中主要的短链脂肪酸[45]。由表3可知，小鼠经过CPA造模后，与模型对照组相比，葡萄籽多酚提取物干预后，小鼠盲肠中乙酸、丙酸、丁酸含量显著升高（P＜0.05），与Henning等[46]、Sun等[47]的研究结果相似。短链脂肪酸可通过肠上皮细胞进入并与宿主细胞相互作用，吸收后在血清中循环并影响宿主的免疫反应和发生疾病的风险，并可抑制具有促进维持免疫稳态的抗炎型细胞作用的组蛋白脱乙酰酶[48]。

表3 葡萄籽多酚对免疫抑制小鼠盲肠中短链脂肪酸含量的影响Table 3 Effect of grape seed polyphonel on short-chain fatty acids contentsin cecum of mice 单位：mmol/L

2.7 短链脂肪酸与肠道菌群分布的相关性分析

短链脂肪酸的浓度与肠道菌群与膳食密切相关[49]。经Pearson相关分析可以得知，短链脂肪酸与肠道菌群的变化量存在相关性，如表4所示。其中：苏黎世杆菌属（Turicibacter）、坦纳拟普雷沃菌属（Alloprevotella）、别样棒菌属（Allobaculum）、Romboutsia属、欧氏菌属（Olsenella）、Murimonas属、嗜胆菌属（Bilophila）与乙酸、丙酸、丁酸含量存在显著正相关（P＜0.05）；乳酸球菌属（Lactococcus）及乳酸杆菌属（Lactobacillus）与丙酸、丁酸含量存在显著正相关（P＜0.05）；双歧杆菌属（Bifidobacterium）与乙酸、丙酸含量存在显著正相关（P＜0.05）。说明这些菌属会在肠道中分解植物多酚等营养物质促进短链脂肪酸的生成，短链脂肪酸通过肠上皮细胞进入并与宿主细胞相互作用，吸收后在血清中循环并影响宿主的免疫反应和发生疾病的风险[48]。Jensen等[38]的研究亦表明，乳酸杆菌属、双歧杆菌属等益生菌可以通过分泌短链脂肪酸诱导和调节T细胞的增殖和分化，塑造肠道内稳定的免疫系统，这就从代谢产物的角度验证了益生菌的益生作用。但Catabacter属与乙酸、丙酸、丁酸含量存在显著负相关（P＜0.05）；另枝菌属（Alistipes）及臭味菌属（Odoribacter）与乙酸含量存在显著负相关（P＜0.05）；厌氧原体属（Anaeroplasma）与丁酸含量存在显著负相关（P＜0.05），这说明短链脂肪酸可以抑制Catabacter属、另枝菌属（Alistipes）、臭味菌属（Odoribacter）及厌氧原体属（Anaeroplasma）等病原菌的增殖。Sanz等[50]研究表明，双歧杆菌属及乳酸杆菌属的生长与短链脂肪酸的生产有关，与本研究得到的结论一致。

表4 短链脂肪酸与肠道菌群分布之间的相关性系数分析表Table 4 Analvsis of correlation coefficient between SCFAsand gut microbiota distribution

3 结论

以葡萄籽多酚为研究对象，通过环磷酰胺诱导建立免疫抑制小鼠模型，利用Illumina MiSeq高通量测序平台探究葡萄籽多酚对免疫抑制小鼠肠道菌群的影响。结果表明：葡萄籽多酚干预能够提高小鼠的胸腺、脾脏指数以及免疫球蛋白（sIgA、IgM、IgG）含量，增强小鼠免疫功能；低剂量葡萄籽多酚干预能够提高肠道菌群多样性，促进乳酸杆菌属、拟杆菌属、狄氏副拟杆菌属、双歧杆菌属、苏黎世杆菌属、坦纳拟普雷沃菌属、别样棒菌属、Romboutsia属的生长，抑制巴恩斯氏菌属、埃希氏菌-志贺氏菌属、艾克曼菌属的生长；同时，乳酸杆菌属及双歧杆菌属等益生菌的增殖，有利于促进SCFAs的产生，进而增强机体免疫能力。该研究结果不仅为植物多酚改善人体健康提供可靠的理论依据，还为以肠道菌群为靶点通过益生元的摄入来预防各类慢性疾病带来了全新的思路和方法，将在保健食品、特殊医学用途食品等领域具有良好的应用前景。