LED光照对气调保鲜菜心叶绿素合成代谢的影响

罗 政，许超群，陈飞平，王 玲，张惠娜，陈于陇,*

（1.农业农村部农产品产后处理重点实验室，北京 100125；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东 广州 510610）

菜心（B rassica campestris L.ssp chinensis L.var.utilis Tsen et Lee）又名菜薹，属十字花科，是广东省栽培面积最大的绿色蔬菜品种之一[1]。菜心等绿色蔬菜的光合效率与其菜叶中的叶绿素含量密切相关，叶绿素含量影响着菜心的保鲜品质和色泽营养状况[2]。

菜心采收后脱离了营养供应，但其细胞内的叶绿素仍然维持着光合固碳和生理代谢，保持果蔬贮藏期间的营养物质积累，同时抑制色泽褪绿黄化，而影响着叶绿素合成降解的重要环境因素是光照和CO2[3]。前人研究表明，控制照光的强度、光质和光谱可有效地维持蔬菜的色泽和叶绿素，延长货架寿命[4-5]。

相比传统的保鲜工艺，光照保鲜处理具有无化学添加、低成本、无毒害、无副产物残留等优点[6]。目前，光照保鲜处理主要使用发光二极管（LED）这种固态照明装置，LED可发射单色光，其半波宽大多为20nm，能够精确地为植物叶绿素进行光合作用提供所需的光谱，提高光能的利用率，且具有光谱波长、发光强度和装置易于控制等优点，常整合到其他设备中（冰箱、保鲜柜等）[7]。

前人通过研究发现，不同蔬菜适用的LED保鲜光谱是不同的[8]。Kobayashi等[9]研究了采用蓝光培育水培莴苣，叶片中的叶绿素含量高于红光。Fan等[10]研究表明，对比白光单色光，采用红蓝光处理的白菜叶绿素生物合成前体含量较高。时月等[11]采用LED红光（620～650 nm）保鲜鲜切生菜，结果表明，该处理能够抑制生菜在货架期间的叶绿素降解，保鲜护绿效果更好。Jiang等[12]研究发现，LED红光保鲜能够抑制采后西兰花叶绿素降解酶基因的表达，减少叶绿素及营养物质的降解，增强抗氧化酶的活性，延缓西兰花的黄化衰老。但是，强光或长时间光照也会促进蔬菜的蒸腾速率和呼吸速率，呼吸会产生高浓度CO2，植物长期处于高浓度CO2环境中会出现光合适应现象[13]，影响叶绿素降解相关酶的活性及叶绿素的合成代谢。

因此，研究贮藏期间叶菜叶绿素的合成代谢不仅要考虑LED单色光的光谱和光强的影响，还需要考虑因光照使叶菜呼吸和蒸腾作用增强导致的贮藏环境温湿度及气体环境的变化。本研究室通过前期研究确认了LED蓝红光对菜心有较好的保鲜效果，结合研究室自主研发的气调包装，探索在LED光照下菜心呼吸增强带来的温湿度变化和CO2浓度增加对菜心贮藏保鲜中叶绿素降解相关酶以及叶绿素合成代谢的影响，为“光照+气调”绿色物理保鲜技术研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

新鲜菜心购于广州市天河区天平架市场，均为当日采摘。

MP20气调包装袋：厚度20μm，O2渗透率11 643 cm3/(m2·d·atm)，水蒸气透过率62.586 g/(m2·d)。

KOH、石油醚、丙酮、HCl、NaOH、KCl、MgCl2、H2O2、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（PBS）、Triton X-100、正己烷、香豆酸、Tris-HCl缓冲液、二硫苏糖醇（DTT），均购于上海生工生物工程有限公司。

1.1.2 仪器与设备

UV1900型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；CARYEclipse荧光分光光度计，德国Eppendorf公司；5810R型冷冻高速离心机，美国ThermoFisher公司；JW-1042低速离心机，PB-10 pH计，德国赛多利斯公司；Checkmate 9900型顶空气体分析仪，丹麦PBI公司。

LED光照保鲜装置由广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所研发（图1）。该装置的LED单色光波长可调节且稳定，不同单色光的配比可调，光照均匀，强度可调。本试验通过预试验研究比对最终选择单色光LED蓝红光，光谱（465±5）nm，主波长为（449±5）nm，光照强度（105±5）lx，纯度86%±2%。

图1 LED光照保鲜装置Fig.1 Fresh keeping equipment for LEDlighting

1.2 方法

1.2.1 样品处理

挑选长短一致、无明显病虫害、无机械损伤的菜心，测试时取第3～6叶片。

试验中菜心均采用广东省农科院蚕业与农产品加工研究所研发的气调袋包装，每袋250 g，共包装24袋，设置分为LED光照处理组12袋和暗处理组12袋。暗处理组在气调包装后就置于室温（20±1.0）℃环境中避光贮藏；LED光照处理组在相同温度条件下，置于LED光照保鲜装置中用LED蓝红光每日照射12 h后避光12 h贮藏（每3 h对包装袋进行翻面，保证正反两面受光均匀）。每24 h对菜心进行取样，测定失重率、呼吸强度、包装内环境气体成分、叶绿素含量和叶绿素合成代谢相关酶活性。每次每处理取样3袋作为重复，每个重复测试3组平行数据。

1.2.2 测定项目与方法

1.2.2.1 贮藏过程中微环境温湿度及气体成分

将温湿度计放入2种处理的包装内，每24 h记录环境的温湿度，记录5 d。

在贮藏库中，不打开2种处理的保鲜袋，用垫贴片贴到保鲜袋上，使用采样探头扎透垫片贴，使用Checkmate 9900型顶空气体分析仪测定保鲜袋内气体成分。

1.2.2.2 呼吸强度

参照陈嘉等[14]的方法，采用静置法，选取固定的500 g菜心置于样品瓶中，静置后利用CO2浓度测定仪测定。呼吸强度计算公式为：

式中：C为CO2浓度，%；V1为样品瓶容积，L；V2为样品体积，L；W为样品鲜重，kg；t为测定时间，h。

1.2.2.3 失重率

采用称重法测定。计算公式为：

式中：X为失重率，%；M0为菜心初始质量，kg；M1为测定时菜心质量，kg。

1.2.2.4 叶绿素含量

参考Shi等[15]的方法测定。将冷冻的菜心组织样品于液氮中研磨成粉末，称取0.5 g样品至离心管中，然后加入4℃预冷的丙酮-乙醇（2∶1）溶液5 mL，摇匀；再将离心管于4℃下以10 000 r/min离心10 min，最后用UV-分光光度计测定上清液在645 nm和663 nm下的吸光度。

1.2.2.5 叶绿素代谢相关酶活性

（1）制备底物叶绿素a（Chl a）

参考闫志成[16]的方法测定。取新鲜菜心叶片，液氮中研磨成粉末，称取5 g样品至50 mL离心管中，加入-20℃预冷的丙酮10 mL，黑暗条件下浸提12 h，于4℃下以10 000 r/min离心15 min，采用分光光度计测定上清液在645、663 nm下的吸光度值（OD值）。稀释上清液至叶绿素a的终质量浓度为20μg/mL。配制叶绿素a丙酮溶液时，在避光的通风橱中进行。

叶绿素a浓度（μg/mL）＝12.72A663-2.59A645

（2）脱镁叶绿素a（Phy a）的制备

在Chl a丙酮溶液中加入一滴0.1 mol·L-1HCl，2 min后加入一滴0.1 mol·L-1NaOH中和溶液，此溶液即为Phy a溶液。Phy a浓度的确定通过测定消光系数为156 000 mol·L-1·cm-1、波长为409 nm处的吸光值计算。

（3）丙酮粉的制备

称取样品3 g，加入15 mL冷丙酮（-20℃预冷）振荡混匀，然后于-20℃下静置15 min，再于4℃下以10 000 r/min离心10 min，弃上清，然后再加15 mL冷丙酮，于-20℃条件下静置30 min，再离心10 min，弃上清，重复2～3次直至沉淀绿色全部褪去，得到的沉淀在液氮中干燥，于-80℃冰箱中保存备用。

（4）粗酶液的提取

叶绿素酶（Chlase）的提取：每2 g得到的丙酮粉悬浮于15 mL Chlase提取缓冲液中，30℃下磁力搅拌30 min，然后以10 000 r/min离心5 min，上清液即为粗酶提取液。叶绿素酶提取缓冲液配制见表1。

表1 叶绿素酶提取缓冲液配制（1 L）Table1 Preparation of chlorophyllase extraction buffer(1 L)

（5）脱镁叶绿素酶（PPH）的提取

每1 g得到的丙酮粉悬浮于10 mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，混合液在0℃下搅拌1 h，然后在4℃下以12 000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶提取液。

（6）叶绿素降解的过氧化物酶（Chl-POX）的提取

每1 g得到的丙酮粉悬浮于10 mL 10 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）中，混合液在0℃下搅拌1 h，然后在4℃下以8 000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶提取液。

（7）叶绿素酶（Chlase）活性的测定

参考Han等[17]的方法，反应混合物包括0.5 mL反应缓冲液、0.5 mL Chlase液和0.2 mL 200μg/mL Chl a丙酮溶液，混合物置于25℃水浴中反应40 min，加入4 mL冷丙酮溶液终止反应，再加入4 mL正己烷，混合并充分振荡，然后于4℃下以10 000 r/min离心5 min。测定下层相中生成的叶绿酸a在667 nm处的吸光度值。叶绿素酶（Chlase）反应缓冲液配制见表2。

表2 叶绿素酶反应缓冲液配制（1 L）Table 2 Preparation of chlorophyllase reaction buffer(1 L)

（8）叶绿素降解过氧化物酶（Chl-POX）活性测定

参考Fukasawa等[18]的方法测定。反应混合物包括0.375 mL酶液、0.6 mL 20μg/mL Chl a丙酮溶液、0.15 mL 0.3%H2O2、0.15 mL 1%Triton X-100、0.15 mL 5 mmol/L香豆酸、2.25 mL 0.1 mol/L PBS缓冲液（pH 5.5）。反应混合液在25℃条件下保温10 min，测定668 nm处吸光度值。

（9）脱镁叶绿素酶（PPH）活性测定

参考Aiamla-or等[19]的方法测定。反应混合物包括0.35 mL酶液、75μL 2.0%Triton X-100、0.1 mL Phy a、0.7 mL 50 mmol/LTris-HCl缓冲液（pH 8.0）。反应混合液在25℃下保温90 min，加入4 mL冷丙酮终止反应，再加入4 mL正己烷，混合并充分振荡，然后于4℃下以10 000 r/min离心5 min，然后测定丙酮层的脱镁叶绿酸a在667 nm处的吸光度值。

1.2.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 17.0软件进行数据计算、绘制图表和分析。

2 结果与分析

2.1 LED光照对气调包装菜心外观品质的影响

本试验中气调包装菜心在室温（20±1.0）℃贮藏4 d后，外观品质如图2所示。LED光照处理组的菜心色泽及外观品质优于暗处理组，菜心茎秆完整，未出现腐烂、干瘪的现象，菜叶色泽保持鲜绿且未发生萎蔫黄化，而暗处理组菜心叶片明显转黄，茎秆腐烂并出现异味。因为LED光照具有一定的抑菌作用，在贮藏期间延缓了菜心的腐烂变质，同时降低了叶绿素代谢相关酶活性，从而延缓了黄化。

图2 LED光照对菜心外观品质的影响Fig.2 Effects of different LED monochromatic illumination on fresh keeping quality of Chinese flowering cabbages

2.2 LED光照对气调包装菜心气体环境的影响

O2/CO2含量在一定程度上反映了果蔬在贮藏过程中的呼吸强度[20]。CO2作为植物进行光合作用的重要原料之一，也是植物气孔反应、光合作用及光合同化物分配的调节者，其浓度过高或过低都会影响植物的光合作用及呼吸代谢。本试验中，两种处理下气调包装袋内的气体成分变化如图3所示。由于室温（20±1.0）℃下菜心的生理代谢旺盛，呼吸强度大，两种处理气调包装袋内的O2含量均在贮藏1 d就消耗至1%以下。整个贮藏期间，随着气调袋O2的补充，光照处理组菜心由于呼吸作用受到了抑制，在贮藏2 d后，O2含量开始不断回升；暗处理组则由于较强的呼吸作用，O2含量持续下降。同时，两种处理在贮藏期间包装内的CO2含量均呈上升趋势，但是由于光照处理对菜心呼吸代谢的抑制以及气调袋对CO2的透过性影响，光照处理组气调袋内的CO2含量在第2天开始趋于稳定，无明显上升；暗处理组则由于菜心在贮藏4 d时已经出现腐烂，CO2含量急速上升。

图3 LED光照对气调包装菜心气体环境的影响Fig.3 Effects of LED illumination on gasenvironment of Chinese cabbagesunder modified atmosphere packaging

2.3 LED光照对气调包装菜心呼吸强度的影响

呼吸强度可以反映菜心在贮藏期间的生理代谢活动。室温（20±1.0）℃下贮藏的菜心其呼吸强度相对冷藏时要高，营养物质消耗快，衰老黄化也会加速，因此贮藏期变短。如图4所示，贮藏初期，暗处理和LED蓝红光照射都能抑制气调包装菜心的呼吸强度，延缓其衰老腐烂的发生。从贮藏3 d开始，暗处理菜心的呼吸强度开始剧烈上升，而暗处理菜心的腐烂劣变也在同一时间开始；贮藏4 d时，暗处理菜心的呼吸强度为LED光照处理组的1.8倍。LED蓝红光照射下，气调包装菜心的品质始终保持良好，无明显的腐烂黄化现象发生，且呼吸强度在贮藏3 d上升，之后趋于平缓，整个贮藏期间光照处理组菜心的呼吸强度均显著低于暗处理组（P＜0.05）。上述结果表明LED光照处理能够有效抑制菜心的呼吸，减少营养物质的消耗，有利于其保鲜保绿。

图4 LED光照对气调包装菜心呼吸强度的影响Fig.4 Effects of LED illumination on respiration intensities of Chinese flowering cabbages under modified atmosphere packaging

2.4 LED光照对气调包装菜心失重率的影响

如图5所示，室温（20±1.0）℃贮藏条件下，两种处理气调包装菜心的失重率均随着时间的延长呈上升趋势，其中由于贮藏4 d时暗处理组的菜心已经出现了明显的腐烂，其失重率也明显上升。贮藏0～3 d时，暗处理组菜心失重率同样显著高于光照处理组（P＜0.05），这是植物的光合作用促进菜心的营养物质积累所致。但光照会促进菜心的蒸腾作用而导致失水率增加，王亚会等[21]采用光照处理同样发现其促进了西芹的光合作用，不利于水分的保持。但在贮藏后期，光照处理组菜心质量维持稳定，失重率并未出现明显增幅。

图5 LED光照对气调包装菜心失重率的影响Fig.5 Effects of LED illumination on weight loss rate of Chinese flowering cabbagesunder modified atmosphere packaging

2.5 LED光照对气调包装菜心叶绿素含量的影响

叶绿素含量影响着果蔬的色泽和新鲜度[22-23]。如图6所示，室温（20±1.0）℃贮藏条件下，两种处理气调包装菜心的叶绿素含量均随着贮藏时间的延长呈下降趋势，但暗处理组菜心叶绿素含量的下降趋势比光照处理要更明显。贮藏2 d时，光照处理气调包装菜心的叶绿素含量开始显著高于暗处理组（P＜0.05），3 d时仍保持较高的叶绿素含量，相较暗处理组的菜心叶绿素含量高10%。推测原因可能是：LED蓝红光的照射促进了菜心叶绿素合成酶的活性，同时抑制了叶绿素降解酶活性，结合光照处理具有较低的呼吸消耗，使得菜心的叶绿素降解得到了延缓。

图6 LED光照对气调包装菜心叶绿素含量的影响Fig.6 Effects of LED illumination on chlorophyll content of Chinese flowering cabbagesunder modified atmosphere packaging

2.6 LED光照对气调包装菜心叶绿素酶活性的影响

叶绿素酶主要位于叶绿体的内膜上，作用于叶绿素酶促降解的最初步骤。叶绿素酶使叶绿素被催化脱掉植醇基，变成叶绿素酸酯，在叶绿素迅速降解和大量合成期间都能检测到该酶[24]。如图7所示，室温（20±1.0）℃条件下，两种处理气调包装菜心的Chlaes活性随着贮藏时间的延长先下降后上升。可知避光处理和LED蓝红光照射处理都能一定程度降低菜心的生理代谢活动。贮藏期间，暗处理组气调包装菜心的Chlaes活性始终显著高于光照处理组（P＜0.05），贮藏4 d时LED光照处理组的菜心Chlaes活性仍低于初值，说明LED蓝红光照射能够有效抑制Chlaes活性，延缓叶绿素的降解。暗处理4 d时，菜心Chlaes活性为初值的1.8倍，菜心出现明显的黄化现象。

图7 LED光照对气调包装菜心叶绿素酶活性的影响Fig.7 Effects of LED illumination on chlase activity of Chinese flowering cabbages under modified atmosphere packaging

2.7 LED光照对气调包装菜心脱镁叶绿素酶活性的影响

脱镁叶绿素酶可以将叶绿素a降解为脱镁叶绿素[25-26]，该酶作为仅有的被发现可催化叶绿素a酸酯转变成为脱镁叶绿素甲酯酸a功能的酶，是参与叶绿素降解代谢的酶中最主要的关键性酶[26]。如图8所示，室温（20±1.0）℃贮藏条件下，暗处理组气调包装菜心的PPH活性随贮藏时间的延长呈上升趋势，而LED光照处理组的菜心PPH活性则随着贮藏时间的延长先下降后上升。贮藏4 d时，暗处理组气调包装菜心的PPH活性为初值的2.4倍，菜心褪绿明显。在贮藏期间，LED蓝红光照射能够有效延缓菜心PPH活性的升高，并在贮藏前期显著抑制其活性，维持菜心的叶绿素含量。

图8 LED光照对气调包装菜心脱镁叶绿素酶活性的影响Fig.8 Effects of LED illumination on PPH activity of Chineseflowering cabbagesunder modified atmosphere packaging

2.8 LED光照对气调包装菜心叶绿素降解过氧化物酶活性的影响

如图9所示，室温（20±1.0）℃贮藏条件下，两种处理气调包装菜心的Chl-POX活性均随着贮藏时间的延长呈上升趋势。总体而言，LED光照处理组气调包装菜心Chl-POX活性的增长趋势于贮藏3 d开始变缓，且贮藏期间活性显著低于暗处理组（P＜0.05），贮藏4 d时，暗处理组菜心Chl-POX活性为LED光照处理组的1.4倍，LED蓝红光照射能够有效抑制叶绿素合成底物的氧化，减少菜心叶绿素的降解损失。

图9 LED光照对气调包装菜心叶绿素降解过氧化物酶活性的影响Fig.9 Effects of LED illumination on Chl-POXactivity of Chinese flowering cabbagesunder modified atmosphere packaging

3 讨论

3.1 LED光照处理对气调包装菜心呼吸代谢的影响

LED光照能够在室温下产生光催化作用，深度氧化有机物，使其分解为CO2和H2O，光催化后的空气具有良好的杀菌能力[27]。同时光催化产生的负离子作用于果蔬表面，可以降低呼吸酶活性，消耗气调包装内的氧气，并生成适量的二氧化碳，使果蔬的呼吸作用受阻，从而延长果蔬的贮藏期[28]。本研究中，气调包装菜心在间歇式的每日12 h LED蓝红光照射下，呼吸强度相较暗处理组显著下降，且贮藏期间无腐烂劣变现象。李宁等[29]的研究中同样发现，通过LED红蓝光处理可以推迟西兰花呼吸跃变时间10 d左右，并且降低了呼吸强度的峰值。

植物可以通过光合作用消耗环境中的CO2为植物的生理代谢提供能量[30]，积累营养物质，从而延长其贮藏寿命。本研究中，LED蓝红光照射下气调包装菜心袋内的CO2浓度相比暗处理组低，同时菜心失重更少，原因是菜心的光合固碳作用消耗了包装内的CO2，合成了菜心生理代谢所需的碳水化合物，从而保持其新鲜品质。张志刚等[31]通过低温弱光处理辣椒，使辣椒的蒸腾速率下降，净光合速率更高，有效减少了贮藏期间的碳水化合物消耗和水分散失。雷静等[32]研究表明，LED红蓝单色弱光照射后樱桃番茄的后熟效果更优，果实中积累的营养物质含量高，从而延缓其成熟衰老。伍新龄等[33]研究发现，与无光对照相比，LED红蓝复合光间歇照射西兰花能抑制植物组织营养物质的流失速率，货架期可延长5 d以上。

3.2 LED光照处理对气调包装菜心叶绿素合成代谢的影响

植物可吸收的可见光波长主要集中在蓝紫光（450 nm）和红橙光段（波长660 nm）[29]。本研究通过前期试验发现低照度LED蓝红光对菜心品质和叶绿素含量的保持效果较好。Dhakal等[34]研究表明，LED蓝光处理番茄的货架期比避光和红光处理更长，有利于保持番茄红素含量。

光照对于叶菜品质及叶绿素代谢的影响是多方面的：光照不足会限制植物的光合固碳能力和光合作用关键酶活力，导致叶绿素合成减少；光照过强不仅会促进植物的呼吸作用和叶绿素氧化降解酶活性，还会对植物产生光抑制，进而抑制叶绿素合成[35]。

本研究将气调包装处理的菜心在室温下贮藏，发现在每日间歇式的12 h LED蓝红光照射作用下，包装菜心的叶片黄化和萎蔫相较避光处理受到了抑制，叶绿素降解的相关酶活性降低，使叶绿素的降解受到抑制，同时在照光期间促进了叶绿素的合成，消耗和再生达到了平衡，叶绿素含量得到了较好的保持。

LED光照促进了菜心的光合作用释放了CO2，同时气调包装保留了菜心呼吸在包装内积累的CO2，CO2既能作为暗反应固碳的原料，促进叶绿素的合成，又能与光照协同抑制叶绿素降解酶的活性。孙志文等[36]在研究中发现，随着CO2体积分数的增加，叶绿素还原酶和脱镁叶绿素酶活性均受到明显抑制，有效阻止了西兰花的黄化进程。Braidot等[37]研究表明，低强度光照间隔照射保鲜莴苣可以激活部分莴苣的光合作用，使之可以进行固碳作用，并合成用于延迟衰老的生物活性分子，从而有效保持了采后莴苣的叶绿素、类胡萝卜素和抗坏血酸含量。Veierskov等[38]则指出，一定浓度CO2利于植物叶片维持叶绿素含量，但CO2对叶绿素降解的抑制具有量的效应。

因此菜心室温贮藏期间，通过LED红蓝光照不仅可以抑制叶绿素降解酶活性，同时可以促进包装菜心生理代谢积累CO2，有利于植物将所吸收的光能比较高效地转化为生物化学能，为碳同化作用提供更为充足的能量，有效提高了植物的净光合速率[39]。“LED光照+气调”保鲜方式对菜心叶绿素含量的维持、色泽品质的保持相较避光气调包装效果更优。

4 结论

本研究中发现，光照处理对气调包装菜心叶绿素合成代谢的影响是多方面的：一方面LED光照可抑制叶菜的呼吸作用，降低其营养物质的消耗，增加贮藏环境中的CO2浓度，从而为叶菜体内有机物的合成提供碳源，有利于叶菜营养物质的积累；另一方面，LED光照处理抑制了叶绿素降解相关酶的活性，能够很好地保持叶菜在贮藏期间的色泽；同时推测LED光照的灭菌作用能够有效地延缓叶菜的腐烂劣变。综上所述，“LED光照+气调”的保鲜方式能够很好地保持叶菜在货架贮藏期间的良好品质，有利于叶菜的护绿，具有良好的应用前景。