大孔树脂纯化襄荷黄酮提取物及其对小鼠运动性疲劳的影响

李 奕

（中国戏曲学院体育部，北京 100073）

襄荷（Zingiber mioga（Thunb.）Rosc）为姜科属多年生草本植物，具有活血调经、消肿解毒的功效，是保健食品的主要成分[1-2]，富含多糖、黄酮、氨基酸、维生素等化学物质[3-4]。目前国内外对于襄荷的研究多集中于栽培繁殖、提取分离等方面，其中许远和张思颉等[5-6]曾利用乙醇超声提取襄荷总黄酮，并发现其在体外对多数活性氧自由基具有较好的清除作用，但未深入探究其体内活性。“运动性疲劳”主要源于剧烈运动时体内生成的大量活性氧或自由基导致肌肉组织的损伤和收缩能力的下降，进而影响身体的持续运动[7-8]。目前某些天然化合物已被发现其体、内外抗氧化活性高度相关[9]，本研究利用大孔树脂具有机械筛分与吸附分离杂质的特性[10-11]，采用其纯化襄荷黄酮提取物，并考察纯化产物对小鼠运动性疲劳的影响，从而为有关襄荷运动食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

新鲜襄荷采自湖北恩施市；西洋参：昆明邦宇制药有限公司生产；芦丁对照品：中国药品生物制品检定研究院；乳酸（LA）、尿素氮（BUN）和乳酸脱氢酶（LDH）活力检测试剂盒：泉州九邦生物科技有限公司；试验用水为去离子水；其余试剂均为分析纯；试验动物：雄性小鼠100只，体重18～25 g，喂养环境温度：20～25℃、相对湿度：50%～70%，由北京实验动物中心提供。

1.1.2 仪器与设备

UV-8000型紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；DT-J300型制样粉碎机：湖南顶特科技有限公司；BSA124S型电子天平：赛多利斯公司；TL-ST250型超声波细胞粉碎机、FD-1A-50型冷冻干燥箱：江苏天翎仪器有限公司；RE-201D型旋转蒸发仪：上海岐耀仪器设备有限公司；KH20R-II型高速离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；THD-200型恒温振荡器：北京亚泰科隆仪器有限公司；AB-8、H-103、D-101型大孔树脂：天津波鸿树脂科技有限公司；HPD 400、NKA-9型大孔树脂：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黄酮提取液的制备

依照文献[5]的方法制备襄荷黄酮提取液，最小提取量的具体操作如下：将襄荷根、叶、花苞洗净后烘干、粉碎，取10.0 g过80目筛后样品，加入至200 mL 80%乙醇溶液超声提取（温度50℃，功率100 W）。滤渣经3次重复提取后，合并滤液，蒸发浓缩移至100mL容量瓶内，加入60%乙醇溶液定容、摇匀，即得黄酮提取液。

1.2.2 黄酮含量测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝法，平行6次测定不同浓度标准品溶液中总黄酮含量[12]，绘制标准曲线方程：y=1.043x+0.011 7（r=0.993 6），其中横坐标为质量浓度，纵坐标为吸光度值。随后，不同洗脱液样品通过标准曲线方程确定总黄酮含量，减压蒸发，浓缩干燥后称重，进而得到产物的黄酮纯度。

1.2.3 树脂型号选择

分别称取5.0g预处理后的H-103、D-101、AB-8、HPD-400、NKA-9树脂[13]，放入装有6 mg/mL 60 mL黄酮提取液的锥形瓶内，在室温下静态吸附12 h后过滤。饱和吸附后的树脂经一定量水洗至无提取液残留后，置于锥形瓶内，加入60%乙醇100 mL，室温静置12 h后过滤，按照下列公式计算不同类型树脂的饱和吸附量、饱和吸附率、洗脱率及回收率[14]。

式中：me为吸附平衡后总黄酮质量，mg；m0为样液初始总黄酮质量，mg；m为树脂干重，g；md为洗脱液中总黄酮质量，mg；τe为饱和吸附量，mg/g；Qe为饱和吸附率，%；Dd为洗脱率，%；R为回收率，%。

1.2.4 等温吸附试验

向装有5.0 g AB-8大孔树脂的锥形瓶内分别加入浓度为2、4、6、8、10 mg/mL的黄酮提取液60 mL，于25、35、45℃振荡吸附，测得树脂的饱和吸附量，绘制等温吸附线，并利用Langmuir与Freundlich模型拟合[15]。

式中：Qm为黄酮饱和吸附量，mg/g；Qe为黄酮吸附量，mg/g；Kb为Langmuir方程常数；Ce为滤液黄酮浓度，mg/mL；Kf为Freundlich方程常数。

1.2.5 静态吸附动力学曲线

向装有6 mg/mL襄荷黄酮提取液60 mL的锥形瓶内加入5.0 g AB-8大孔树脂，于25℃振荡吸附，在不同时间取样检测上清液中黄酮含量，绘制静态吸附动力学曲线[16]。

1.2.6 动态吸附与洗脱条件考察

固定上样浓度6 mg/mL、上样液pH为6、上样流速3 mL/min和上样液体积60 mL，考察不同上样浓度（2、4、6、8、10 mg/mL）、不同上样液pH（3、4、5、6、7）对树脂的吸附率影响，绘制不同上样流速（1、3、5 mL/min）时树脂泄漏曲线；固定洗脱液乙醇浓度60%、洗脱液体积150 mL、洗脱流速2 mL/min，考察不同洗脱液浓度（50%、60%、70%、80%、90%）对黄酮化合物洗脱率的影响及1、2、3 mL/min洗脱流速下的洗脱曲线。

1.2.7 抗运动性疲劳实验

1.2.7.1 试验设计

所有小鼠经适应性喂养7 d后，随机平均分为空白对照组、阳性对照组和低、中、高剂量组，根据《保健食品功能评价》要求，低、中、高剂量组分别灌胃纯化后的黄酮化合物0.10、0.20、0.30 mg/（g·d），阳性对照组给予西洋参灌胃0.10 mg/（g·d），空白对照组则采用生理盐水灌胃，全部动物每天灌胃1次，连续灌胃30 d，灌胃期间可自由喂食与饮水[17-18]。

1.2.7.2 负重游泳试验

最后一次灌胃结束后，各组随机抽取10只小鼠，并在鼠尾绑定5%体重重物，放入泳池游泳，记录其入水到沉入水底超过10 s的时间[19]。

1.2.7.3 体内生化指标检测

剩余小鼠游泳运动60 min后，放入鼠笼休息10 min，处死采取血清，按照相关试剂盒使用说明，检测各组小鼠运动后体内LA、BUN浓度和LDH活力[20]。

1.2.8 数据处理

相关试验数据通过SPSS19.0软件进行方差分析，比较组间差异，当P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同类型树脂吸附与解吸性能比较

表1为不同型号树脂对襄荷黄酮的吸附与解吸性能，从表1可见，各类树脂对襄荷黄酮的吸附率与洗脱率差异明显，究其原因在于各类树脂的比表面积与极性不同。AB-8大孔树脂对襄荷黄酮的吸附率最高，达到89.2%，且回收率超过80%，其他树脂对其回收率从高到底依次为：HPD-400＞H-103＞D-101＞NKA-9，这可能源于黄酮化合物的结构中存在较多羟基衍生物，具有一定极性，因此与弱极性树脂的相互作用较好[21]，因而确定采用AB-8树脂进行后续试验。

表1 不同树脂的吸附率、洗脱率及回收率比较Table 1 Comparison of adsorption rate,elution rate and recovery rate of different resins(n=6)

2.2 等温吸附试验

图1为AB-8大孔树脂于不同温度对襄荷黄酮的等温吸附曲线，随着提取液浓度的增大，树脂的饱和吸附量逐渐增大，然而随着温度升高，其饱和吸附量却不断减小，分别利用Langmuir和Freundlich吸附模型对其等温吸附线拟合，见表2。从表2可知，在不同温度下，AB-8大孔树脂的吸附曲线符合Langmuir模型特征，各方程的相关系数均大于0.95。

表2 等温吸附线拟合方程Table 2 The fitting equations of adsorption isotherms

图1 等温吸附曲线Fig.1 Adsorption isothermsin different temperatures

2.3 静态吸附动力学曲线

从图2可知，在0～3 h内，树脂对黄酮的吸附率迅速升高，随后缓慢于6 h达到平衡，表明AB-8大孔树脂对襄荷黄酮的吸附速率较快，具有实际应用前景。

图2 AB-8大孔树脂对襄荷黄酮的静态吸附动力学曲线Fig.2 The static adsorption kinetics curve of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavonoid by AB-8 macroporousresin

2.4 吸附条件选择

2.4.1 上样浓度对吸附率的影响

图3为不同上样浓度对AB-8树脂吸附襄荷黄酮的影响，当上样浓度为6 mg/mL时，吸附率达到最高为87.8%，上样浓度过高时，黄酮溶解度下降，容易导致树脂的堵塞或泄露，同时竞争吸附的杂质也越来越多，致使黄酮吸附率进一步降低，因此襄荷黄酮最适宜上样浓度为6 mg/mL。

图3 上样浓度对吸附率的影响Fig.3 Effect of sampleconcentration on the adsorption rate

2.4.2 上样液pH对吸附率的影响

图4为不同上样液pH对AB-8树脂吸附襄荷黄酮的影响，从图4可见，吸附率随pH的升高出现先增大后减小的趋势。当pH为6时，吸附率达到最高，为88.4%，这可能源于黄酮化合物的化学结构含有1-氧原子，存在未共用电子对，表现出碱性，因而在强酸下易形成“徉盐”，不利于树脂的吸附，这与黄酮纯化相关研究结果一致[22-23]，因此考虑最适宜上样液pH为6。

图4 上样液pH对吸附率的影响Fig.4 Effect of sample pH on the adsorption rate

2.4.3 不同上样流速下树脂泄漏曲线

图5为不同上样流速下树脂的泄露曲线，从图中可知，随着上样液体积的增加，泄露液中黄酮化合物的浓度逐渐增大至完全等于上样液初始浓度，这归因于若上样液体积过多且流速过快时，黄酮化合物不能与树脂充分接触发生吸附作用，且树脂易于过载。通常认为泄漏液中黄酮浓度约为10%上样浓度时，树脂开始泄漏，考虑实际吸附效率，选择最适宜上样流速为3 mL/min，上样液体积60 mL。

图5 不同上样流速下树脂的泄漏曲线Fig.5 The leakagecurve of resin at different loading flow rates

2.5 洗脱条件选择

2.5.1 洗脱液浓度对洗脱率的影响

图6为不同浓度洗脱液对树脂洗脱率的影响，当洗脱液乙醇浓度超过60%时，树脂的洗脱率开始逐渐降低，这是由于洗脱液浓度越大，其极性愈低，易于洗脱黄酮，但浓度过高时，其与黄酮化合物的极性差异明显，洗脱难度变大，因此洗脱液乙醇的最适宜浓度为60%。

图6 洗脱液浓度对洗脱率的影响Fig.6 Effect of eluent concentration on theelution rate

2.5.2 不同洗脱流速的解吸曲线

若洗脱流速过快，洗脱剂与树脂内吸附的黄酮作用力变弱，为此考察不同洗脱流速下的解吸曲线，结果见图7。随着洗脱流速增大，完全洗脱吸附在树脂内的襄荷黄酮所消耗的洗脱剂用量越来越多，当以2 mL/min流速洗脱吸附树脂时，洗脱曲线单一、对称、尖锐且无明显拖尾，因此选择最宜洗脱流速为2 mL/min，洗脱液体积150 mL。

图7 三种洗脱流速下的解吸曲线Fig.7 Thedesorption curveat three eluent flow rate

2.6 验证性试验

综上所述，确定大孔树脂纯化襄荷黄酮提取物的最佳纯化工艺为：60 mL上样浓度为6 mg/mL襄荷黄酮（pH 6.0），上样流速3 mL/min，洗脱流速为2 mL/min，洗脱液乙醇浓度60%，洗脱液体积为150 mL，饱和吸附率与洗脱率分别达到87.5%和90.3%，产物的总黄酮纯度由11.25%±0.46%提高至47.52%±1.37%，约为4.2倍，表明通过AB-8大孔树脂纯化后，襄荷黄酮提取物中的蛋白、色素等杂质被有效去除，因此该树脂适于襄荷黄酮提取物的纯化。

2.7 抗运动性疲劳实验结果

2.7.1 襄荷黄酮对小鼠负重游泳时间的影响

负重游泳时间可真实反映动物的运动耐力。从表3可知，在设定的剂量范围内，随着纯化产物剂量的增大，动物负重游泳时间呈现出一定的剂量依赖性。与空白对照组相比，中、高剂量组动物的负重时间均有延长，具有极显著性差异（P＜0.01），表明中、高剂量的襄荷黄酮有助于提高机体的运动耐力，延长运动时间，而低剂量组虽有延长，但差异不显著，这可能与剂量选择或小鼠的个体差异有关，但阳性对照组小鼠的游泳时间较高剂量组延长1.79 min，差异具有极显著性（P＜0.01）。

表3 襄荷黄酮对小鼠负重游泳时间的影响Table 3 Effect of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavonesonexhaustive swimming time of mice

2.7.2 襄荷黄酮对乳酸相关指标的影响

机体过度运动，易造成细胞缺氧，使得部分血糖转化成乳酸，从而影响肌肉张力，而乳酸脱氢酶有利于催化乳酸脱氢，加快其代谢排出[24]。运动后不同组别小鼠体内的乳酸浓度与乳酸脱氢酶活力结果见表4。从表4可知，与空白对照组相较，襄荷黄酮低、中、高剂量组小鼠的体内乳酸浓度均明显偏低，且乳酸脱氢酶活力均有一定幅度的增强，表明襄荷黄酮有助于改善运动后小鼠体内的乳酸与乳酸脱氢酶水平，高剂量小鼠的乳酸浓度较阳性对照组高1.08 mmol/L，乳酸脱氢酶活力较阳性对照组低413 U/L，具有极显著差异（P＜0.01）。

表4 襄荷黄酮对小鼠BLA浓度和LDH活力的影响Table 4 Effect of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavoneson BLA concentration and LDH activity in mice

2.7.3 襄荷黄酮对尿素氮浓度的影响

机体剧烈运动，导致血糖供应不足，容易造成体内蛋白质或氨基酸的分解利用，致使代谢产物尿素氮浓度增大[25]。表5为运动后不同组别动物体内尿素氮浓度，从表5可知，空白对照组的尿素氮浓度与低剂量组相较无显著性差异，而中、高剂量组小鼠的尿素氮浓度均明显低于空白对照组，表明机体在剧烈运动时，中、高剂量的襄荷黄酮有利于减少体内蛋白质分解，高剂量组与阳性对照组均与空白对照组有极显著差异（P＜0.01）。

表5 襄荷黄酮对小鼠BUN浓度的影响Table5 Effect of Zingiber mioga(Thunb.)Rosc flavoneson BUN concentration in mice

3 结论

本研究探讨了大孔树脂纯化襄荷黄酮的最佳工艺条件，并分析纯化产物对小鼠运动性疲劳的影响。通过单因素试验得到最佳纯化工艺条件为：60 mL上样浓度为6 mg/mL襄荷黄酮（pH 6.0），上样流速3 mL/min，洗脱流速为2 mL/min，洗脱液乙醇浓度60%，洗脱液体积为150 mL，产物的总黄酮纯度由11.25%提高至47.52%，约为4.2倍。从动物实验结果可知，襄荷黄酮可明显延长小鼠的负重游泳时间，增强乳酸脱氢酶的活性，降低了机体的尿素氮含量，从而减小运动过程中乳酸的生成及蛋白质或氨基酸的分解，因此该研究可为襄荷黄酮的抗疲劳功能性食品的开发提供参考，有利于促进该资源的开发利用。