基于高通量测序的清香型和酱香型酒曲真菌群落特征研究

陈申习，宿智新，张 磊，林 斌，陈 凯，刘源才，杨 强*

（劲牌有限公司 劲牌研究院 中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 大冶 435100）

白酒是我国具有悠久历史的传统酿造食品，在我国，白酒有多达十几种香型，其中以清香型、浓香型和酱香型为主要三大香型，借助现代品评及检测技术分析，各香型白酒在口感、风格、风味物质含量方面各有自身独特特点，适应并满足了不同消费者多元化的个性需求。

白酒中所含风味物质种类及所占比例是影响白酒品质的重要影响因素之一，如现代白酒品评术语中的绵甜、爽净、醇厚、优雅等词，是由于白酒中含有的醇、醛、酸、酯等特定微量风味物质所决定，而各种风味物质是由酿造使用的酒曲中含有的微生物代谢底物产生的[1]。为了提升白酒产品品质，探究各香型白酒酒曲微生物多样性的差异，分析不同酒曲中微生物的群落结构，尤其是特殊功能性菌株，就显得尤为重要。

近年来高通量测序技术逐渐被应用于各种香型白酒酒曲、酒醅样品分析中，不用分离就可以获知微生物种属信息，为白酒酿造微生物的研究带来了极大的便利[2-3]。徐占成等[4]采用高通量测序对剑南春大曲真菌组成进行了研究，为进一步分析剑南春大曲功能微生物提供了理论依据。杨旭等[5]采用16S rRNA的V3和V4区高通量测序，分析了贾湖酒业集团公司原香型白酒高温大曲细菌结构，指出细菌群落差异是导致白酒品质差异的主要原因之一。吕锡斌等[6]利用Illumina Miseq PE300高通量测序平台对酱香型白酒下造沙轮次的微生物多样性进行了检测，分析了不同阶段微生物群落特点，为深入研究酿造机理提供参考依据。

清香型小曲白酒从工艺上分为传统酒曲法和纯种根霉法生产两种，采用传统酒曲生产法的白酒企业主要分布在湖北、湖南、江西等地，其中劲牌公司生产的小曲白酒产量规模最大[7-8]。目前对清香型小曲白酒酒曲研究主要集中在对酒曲中微生物的种类组成及其代谢成分的解析方面[9-10]。廖美德等[11]描述了绿衣观音土曲的特殊制作工艺及与其他小曲的区别，发现棒曲霉（Aspergillus clavatus）为绿衣观音土曲的主要糖化菌。冯春等[12-13]对绿衣观音土曲中主要微生物种群区系及其功能进行了研究，从土曲中分离出了棒曲霉、黄曲霉、构巢曲霉等真菌，并对酵母、霉菌和细菌之间的相互关系进行了研究[14]。但截至目前关于清香型小曲与其他香型大曲微生物种属差异尚研究不足。本研究以清香型小曲及其制作种曲、清香型大曲以及酱香型大曲为研究对象，采用高通量测序技术对清香型和酱香型酒曲样品开展测序分析，比较分析不同酒曲中真菌种类和多样性，为清香型和酱香型核心微生物的分离、鉴定以及白酒品质提升、白酒差异对比提供重要的真菌资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清香型小曲及其种曲：劲牌有限公司传统制曲车间；清香型大曲：湖北绣林玉液有限公司；酱香型大曲：茅台镇某酱香型酒厂，采样信息及样品编号见表1。

表1 试验所用的样品信息Table 1 Information of sample used in the experiment

1.2 仪器与设备

2720型PCR仪：美国ABI公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一仪器厂；BG-gdsAUTO（130）凝胶成像系统：北京百晶生物科技有限公司；Miseq高通量测序仪：美国Illumina公司；Biotek ELx800酶标仪：美国BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理方法

参照参考文献处理方法[15]，将在车间取得的不同酒曲样品寄送到上海派森诺生物科技有限公司进行基因组DNA提取。

1.3.2 样品DNA提取和聚合酶链式反应扩增

采用DNA提取试剂盒对酒曲样品进行总DNA提取，聚合酶链式反应扩增采用NEB公司Q5高保真DNA聚合酶进行扩增，引物参考文献[15-16]中采用的真菌ITS区通用引物ITS5：（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），ITS2：（5'-GCTGCGTTCTTCATC-GATGC-3'），并严格控制扩增循环数，确保同一批样本的扩增条件一致。PCR扩增体系（25 μL）：反应缓冲液10 μL，dNTP混合液（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，真菌DNA模板2 μL，超纯水8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR扩增程序（25μL）：98℃预变性2min；98℃变性15 s；55℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒对DNA回收，-20 ℃保存。利用DNA定量检测试剂盒对回收的DNA进行精确定量，依托上海派森诺生物科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。

1.3.3 测序文库构建

1.3.4 生物信息学分析

为了整合原始双端测序数据，采用滑动窗口法对FASTQ格式的双端序列逐一作质量筛查。利用FLASH软件对通过质量初筛的双端序列根据重叠碱基进行配对连接，根据每个样本所对应的Index信息，将连接后的序列识别分配入对应样本（要求Index序列完全匹配），从而获得每个样本的有效序列。根据测序序列质量进行初步筛查，运用QIIME软件去除嵌合体等疑问序列，并对获得的序列按97%的序列相似度进行归并和可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）划分。通过将OTU代表序列与对应数据库的模板序列相比对，获取每个OTU所对应的分类学信息。针对真菌的ITS序列，采用UNITE数据库。按照OTU在不同样品中的丰度分布，运用QIIME软件计算每个样品的α多样性水平，并结合稀疏曲线反映测序深度是否合格；α多样性指数计算，常用的度量指数包括侧重于体现群落丰富度的Chao1指数和ACE指数，以及群落均匀度的Shannon指数和Simpson指数。利用SPSS 20.0软件对酒曲样品的真菌属进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。使用Origin v8.5软件，获取各样本在门属分类水平上的组成和丰度分布，并通过柱状图呈现分析结果。

2 结果与分析

2.1 酒曲样品真菌α多样性指数分析

稀释曲线显示每个样本的当前测序深度足以反映该群落样本所包含的微生物多样性。样品有效序列量及OTU值见表2。

表2 酒曲样品真菌序列信息及α多样性指数Table 2 Sequence information and α diversity indexes of fungi in Jiuqu samples

王喆等[15]研究发现，Chao1或ACE指数越大，表明样品群落的丰富度越高。Shannon或Simpson指数值越高，则表明样品群落的多样性越高。如表2所示，8个酒曲样品的Chao1丰富度指数在66～155之间；ACE指数在62.97～155之间；Shannon指数在1.49～3.63之间；Simpson指数在0.41～0.86之间变化。其中，最大指数值均出现在感官略差的土曲TBF，最小值则出现在感官略差的种曲ZBF。各指数表明感官略差的土曲在真菌丰富度和多样性方面均高于感官较好的土曲。而在种曲中，表面带红色的种曲，其真菌丰富度和多样性远高于感官较好和略差的种曲。劲牌桂花曲HHF因其由部分筛选的优势纯菌种和土曲按照优化比例制成，在真菌丰富度和多样性方面略低于土曲TBF，但明显高于酱香型大曲JF和清香型大曲QDF。这说明在劲牌制曲车间，经过多年的连续不间断生产，车间富集驯养了多种多样的酿酒真菌类群，经过开放式培菌制曲，酒曲中真菌的丰富度和多样性处在一个较高的水平，为车间酿造优质原酒提供了丰富的菌种资源。

2.2 酒曲样品中物种的相对丰度

2.2.1 酒曲样品中真菌门的分类

基于酒曲样品中微生物ITS基因序列，8个样品共获得572 846条有效序列，以97%序列相似性将有效序列在门水平上进行聚类，结果见图1。如图1所示，在8个酒曲样品中子囊菌门（Ascomycota）、毛霉门（Mucoromycota）、担子菌门（Basidiomycota）3类真菌占有绝对优势，这三类真菌相对丰度总和均超过93%。其中，大曲样品中主要含有子囊菌门和毛霉门真菌，小曲样品中还含有4.3%～49.2%不等的担子菌门类真菌，特别是感官较好的ZGF种曲样品中，担子菌门占比达到了49.2%，而且在其他两类种曲ZBF和ZRF中占比也超过了10%，说明了种曲的生产工艺、原料等条件更适合富集担子菌门类真菌。

图1 酒曲样品在门分类水平的真菌组成Fig.1 Composition of fungi in Jiuqu samples at phylum level

2.2.2 酒曲样品中真菌属的分类

结合各属的相对丰度，分析了样品中真菌在属水平的分布特点。如图2所示，在各酒曲中前10类真菌属中主要有根霉属（Rhizopus）、曲霉属（Aspergillus）、假丝酵母属（Candida）、Apiotrichum、热子囊菌属（Thermoascus）、红曲霉属（Monascus）、根毛霉属（Rhizomucor）、威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）、毛霉属（Mucor）。在劲牌桂花曲HHF中，根霉属占比最高，达到79.7%，这与桂花曲中增加了筛选的优势根霉菌株有关。除此之外，HHF中还含有7.4%的威克汉姆酵母属，与本研究团队前期使用HHF在清香型小曲白酒机械化生产过程发酵酒醅中分离出了多株异常威克汉姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）相一致[17]。在感官略差的种曲ZBF和清香型大曲QDF中，根霉属占比较低，分别占比0.2%和0.4%，而曲霉属占比较高，分别为76.8%和35.7%。另外，在QDF中还含有较高比例的红曲霉属和根毛霉属，占比都在14%以上。有研究发现[18-20]，红曲霉属可以代谢多种酶类，包括淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等，且可促进底物分解，根霉可以促进淀粉的分解，使淀粉转变成易被酵母利用的葡萄糖等小分子物质[7]，因此推断在QDF中，可能是由较多的曲霉属、红曲霉属和根毛霉属真菌将淀粉分解，从而这三种菌属所占的比例较高。土曲TGF和TBF所检测到的真菌属较为类似，两者曲霉属占比都比较高，分别为26.1%和29.8%，主要原因是土曲中含有较多的棒曲霉（Aspergillus clavatus），这与前期研究[12]发现土曲表面含有大量的棒曲霉的结果一致。在酱香型大曲JF和清香型大曲QDF中，都含有较高比例的热子囊菌属，占比分别为14.5%和20.8%，这可能与这两种大曲的制曲工艺及制曲温度有关。酱香型大曲作为中高温大曲，其制作顶点温度可以达到60 ℃以上，而清香型大曲制曲顶点温度也接近50 ℃，较高的制曲培菌温度，有利于富集筛选周围环境中一些耐高温的微生物[21-22]。

图2 酒曲样品在属分类水平的真菌组成Fig.2 Composition of fungi in Jiuqu samples at genus level

2.4 酒曲样品中真菌主成分分析

酒曲中真菌菌群结构主成分分析结果见图3。

图3 酒曲中真菌菌群结构主成分分析Fig.3 Principal component analysis of fungal structure in different Jiuqu samples

由图3可知，各酒曲真菌群落第一主成分（PC1）贡献率达69.81%，第二主成分（PC2）贡献率达14.52%，累计方差贡献率达到84.33%，表明能够解释样品中的信息。其中，劲牌桂花曲HHF和酱香型大曲JF距离较近，土曲TGF和TBF距离较近，说明HHF和JF以及TGF和TBF的真菌菌落结构较为相似。而种曲ZBF和ZRF及ZGF距离较远，说明ZBF与ZRF及ZGF的真菌菌落结构有较大差距。主成分分析表明不同感官种曲的真菌多样性存在一定差异。

3 讨论

本研究借助现代高通量测序技术研究清楚酒曲中真菌类群特点，揭示了各酒曲样品中真菌的主要类群及差异，造成真菌差异的原因主要与各酒曲制作时的环境、原料、工艺参数有关。制曲车间所用原料、母曲及周围环境形成的独特微生态决定了酒曲中富集的微生物类群，进一步结合工艺酿造出风格不同的白酒[23]。同时，本研究显示在现代制曲技术指导下，劲牌公司生产的传统土曲和桂花曲中真菌丰富度和多样性远超之前人们对小曲的认知，且真菌种类并不比酱香型大曲和清香型大曲少。这与劲牌公司采用的清香型小曲制作工艺不同于川法纯种制曲工艺有关[24]。劲牌传统小曲采用先培养母曲-种曲，然后把种曲与原料混合进行土曲制作，经过一周的开放式控温控湿生产，即可培养完成。这个过程中土曲充分富集了周围环境中多种有益微生物。劲牌桂花曲是在传统土曲的基础上，添加了经现代化工艺生产的天然优势菌种，经比例优化复配而成。既保证了曲中天然有益酿酒微生物的种类数量，又能利用优势菌提高了原料利用率，应用生产后可以显著提高原酒的产量和品质[25]。

借助现代高通量测序技术研究清楚酒曲中真菌类群特点，可以为下步通过传统分离手段鉴定酒曲中的核心微生物提供指导。两种研究方法相结合，可以快速获得酒曲中的核心微生物。在核心微生物功能解析后，挑选其中的优良菌株，通过复配的形式强化到酒曲中，是一种有效提升各种酒曲质量的策略，亦或是通过在制曲车间环境中添加一定比例的优势微生物来提高曲中核心微生物的丰度，同样可以达到提升酒曲质量的目的。

4 结论

通过对清香型小曲及其种曲、清香型大曲和酱香型大曲高通量测序分析，不同酒曲样品中真菌的多样性和丰富度差异明显。其中，劲牌公司在开放式环境下生产的土曲及其种曲真菌的α多样性较高。在门水平上，8个酒曲样品中子囊菌门、毛霉门和担子菌门真菌占有绝对优势，其相对丰度总和均超过93%。在大曲样品中主要含有子囊菌门、毛霉门类真菌，而小曲样品中还含有4.3%～49.2%不等的担子菌，说明了劲牌小曲制作工艺、原料等条件有利于富集担子菌门类真菌。在各酒曲样品中主要真菌属有根霉属、曲霉属、假丝酵母属、Apiotrichum、热子囊菌属、红曲霉属、根毛霉属、威克汉姆酵母属和毛霉属。其中，劲牌桂花曲HHF中，由于添加了筛选的优势根霉菌，根霉属占比达到79.7%。在QDF中含有较高比例的红曲霉属和根毛霉属，代替根霉属进行淀粉原料的分解，行使糖化功能。在酱曲JF和清香型大曲QDF中，热子囊菌属比例较高，分析原因，可能与大曲较高的培菌制曲温度有关。真菌α多样性指数及主成分分析表明不同感官酒曲的真菌多样性存在一定差异，为优化酒曲感官评价标准提供了真菌资源方面的参考。