基于特征肽段的鹿茸及其混伪品种的专属性鉴别研究△

郭晓晗，程显隆，柳温曦，李明华，魏锋，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 100050

《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版一部规定鹿茸为鹿科动物梅花鹿CervusnipponTemminck或马鹿C.elaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，前者称为花鹿茸，后者称为马鹿茸。此外，白唇鹿C.albirostrisPrzewalski和水鹿C.unicolorKerr茸在四川、甘肃地方标准中也可作为鹿茸药用。据市场调研，目前市场上常以驯鹿RangifertarandusLinnaeus茸作为鹿茸销售，伪品、劣品和混淆品的出现导致了鹿茸市场的混乱。作为传统名贵中药材，鹿茸质量控制方法虽多，但并不完善，面对鹿茸掺伪造假及市场的混乱问题，建立一套准确性好、灵敏度高、专属性强的鹿茸真伪鉴别体系尤为重要。

近年来研究表明，鹿茸中蛋白质的含量随生长周期呈较为规律的变化，即蛋白质含量从鹿茸顶部到基部逐渐减少[2]，其含量及种类影响着鹿茸品质的高低，有望成为鹿茸质量评价体系中重要的指标成分。目前以蛋白质或氨基酸为分析对象的动物药检测方法主要有薄层色谱法、凯氏定氮法和分光光度法等。基于胶原蛋白的同源性，不同动物的胶原蛋白具有相似的化学性质[3-4]，因此这些方法难以区分主要含有胶原蛋白大分子的鹿茸及其混伪品。基于生物遗传学特点，虽然同科不同属的鹿茸蛋白序列接近，但必然也存在氨基酸序列上的差异。液相色谱-质谱法(LC-MS)可以针对蛋白质序列进行差异性分析，随着LC-MS在中药检验中的应用，测定动物药中蛋白质成分的方法逐渐成熟[5-14]。因此，本研究采用蛋白质酶切、LC-MS肽段检测及数学统计等方法，找出不同品种鹿茸的特征肽段，建立可用于鹿茸及其混伪品的专属性鉴别方法，为鹿茸及相关制剂的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 试药

花鹿茸40批(编号为HLR-1～HLR-40)、马鹿茸10批(编号为MLR-1～MLR-10)收集于吉林东丰药业有限公司鹿茸养殖基地，驯鹿茸10批(XLR-1～XLR-10)收集于吉林西丰药材市场。60批样品均由辽宁省食品药品检验研究院中药室王维宁主任药师鉴定，分别为梅花鹿CervusnipponTemminck、马鹿C.elaphusLinnaeus或驯鹿RangifertarandusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。

胰蛋白酶、亮氨酸脑啡肽、甲酸(Sigma-Aldrich公司)；乙腈(Thermo Fisher Scientic公司)；碳酸氢铵(国药集团化学试剂有限公司)；水为Milli-Q纯水。

1.2 仪器

Synapt G2-S型Q-TOF MS液相色谱质谱联用仪，XevoTM TQ-S MS型液相色谱质谱联用仪(美国Waters公司)；FED-115型热循环干燥箱(德国Binder公司)；DH-101-2BS型恒温恒湿培养箱(天津市中环实验电炉有限公司)。

2 方法与结果

2.1 驯鹿茸专属性特征肽段的研究

2.1.1色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITYTM UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温为40 ℃；进样量为5 μL；流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～25 min，95%～80%A；25～40 min，80%～50%A)；流速为0.3 mL·min-1。

2.1.2质谱条件 选用电喷雾离子源，正离子模式；离子源温度为120 ℃；毛细管电压为3 kV，锥孔电压为20 V；去溶剂温度为450 ℃，去溶剂气体流速为600 L·h-1；全信息串联质谱(MSE)连续方式采集数据，扫描质量数m/z50～1200，扫描时间为0.2 s；低碰撞能量为8 V，梯度碰撞能量为10～40 V；碰撞气体为高纯氩气。

2.1.3溶液制备 胰蛋白酶溶液：取适量胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液溶解，制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液。

空白溶液：取1%碳酸氢铵溶液，滤过，取续滤液100 μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液20 μL，充分混匀，于恒温恒湿箱中酶解12 h，即得。

供试品溶液：取供试品粉末约0.3 g于安瓿瓶中，加水10 mL，熔封，于烘箱中120 ℃加热12 h，取出，趁热滤过，蒸干，用1%碳酸氢铵溶液溶解并定容至10 mL，用微孔滤膜滤过，取续滤液100 μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液20 μL，充分混匀，于恒温恒湿箱中酶解12 h，即得。

2.1.4数据采集 利用UPLC-Q-TOF MS系统，在2.1.1～2.1.2项下色谱和质谱条件下，分别对空白和供试品溶液进行数据采集，得到3种鹿茸样品的总离子流图，见图1。以驯鹿茸样品(XLR-1)为例，选择提取在整个数据采集过程中保留时间均匀分布的8个共有色谱峰进行方法学考察，分别为m/z739.839 6、m/z583.813 5、m/z790.885 7、m/z575.820 3、m/z793.885 0、m/z780.907 8、m/z931.788 9、m/z711.374 6。相应的提取离子色谱图见图2。

注：A.花鹿茸(HLR-1)；B.马鹿茸(MLR-1)；C.驯鹿茸(XLR-1)。图1 花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸酶解肽的总离子流图

图2 驯鹿茸样品(XLR-1)8个色谱峰的提取离子流色谱图

2.1.5精密度试验 取供试品溶液，按照2.1.1～2.1.2项下色谱和质谱条件，重复进样6次，选取上述8个单一色谱峰进行提取，测得8个色谱峰保留时间和精确质量数的RSD均小于1%。

2.1.6重复性试验 取同一份样品6次，每次约0.3 g，精密称定，制备供试品溶液6份，按照2.1.1～2.1.2项下色谱和质谱条件分别进样，选取上述8个单一色谱峰进行提取，测得8个色谱峰保留时间和精确质量数的RSD均小于1%，结果表明，重复性较好。

2.1.7稳定性试验 取供试品溶液，按照2.1.1～2.1.2项下色谱和质谱条件，分别在0、2、4、6、8、10 h测定。选取上述8个单一色谱峰进行提取，测得8个色谱峰的保留时间和精确质量数基本保持一致，RSD均小于1%，说明样品在10 h内稳定。

2.1.8数据分析 利用Waters统计分析软件，设定保留时间为1～40 min，质谱允许偏差为0.05 amu，保留时间偏差设为0.2 min，设定适宜的噪音消除水平和强度阈值。先将60批样品的液质图谱数据降维，转换成数据对(精确质量-保留时间，EMRT)；并进行主成分分析，结果见图3。结果显示，驯鹿茸可与花鹿茸、马鹿茸进行良好的区分。将花鹿茸和马鹿茸合并为一组，结合正交偏最小二乘法-判别分析对数据进行整合分析，得到驯鹿茸与正品鹿茸的数据分析结果散点图，见图4。在轮廓呈S形的散点图(S-plot)中，曲线两端的EMRT数据对代表了来自2个样品组的可信度高的特征离子。

注：HLR.花鹿茸；MLR.马鹿茸；XLR.驯鹿茸。图3 驯鹿茸与花鹿茸、马鹿茸的主成分分析

图4 驯鹿茸与花鹿茸、马鹿茸比较的S-plot散点图

经过数据分析软件对质谱数据的分析、挖掘与筛选，并在总离子流图中初步验证的情况下，最终寻找到2个驯鹿茸专属性较好的离子，分别为m/z575.820 3(9.48 min，双电荷)、m/z583.813 5(8.05 min，双电荷)。这2个特征离子在驯鹿茸与花鹿茸、马鹿茸中的相对离子强度分布见图5。为确认这2个离子的灵敏度及准确性，利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ/MS)，分别选择m/z575.8和m/z583.8为母离子，优化其传输电压和碰撞能量，结合选择离子模式和子离子模式，分别确定了2个子离子，从而形成4组离子对，分别是8.38 min：m/z583.8→m/z455.9、m/z583.8→m/z910.7；9.80 min：m/z575.8→m/z447.9、m/z575.8→m/z894.8。

注：A.m/z 575.820 3；B.m/z 583.813 5。图5 2个特征离子m/z 575.820 3、m/z 583.813 5在3种鹿茸样品中的相对强度分布

2.1.9驯鹿茸专属性特征肽段的验证 在优化好的传输电压和碰撞能量下，基原准确的花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸样品溶液及空白溶液在多反应监测(MRM)模式下测试，结果显示，这4组特征离子对均只在驯鹿茸样品中检测到，说明这4组特征离子对具有专属性，可用于正品鹿茸(梅花鹿、马鹿)样品中混有伪品鹿茸(驯鹿)的专属性鉴别。

2.2 鹿茸特征图谱的研究

根据对正品鹿茸的酶解肽段的数据分析，以总离子流色谱图中两者共有、保留时间合适、响应高为原则，经过比较，确定4个离子为候选母离子，见表1。结合UPLC-QQQ/MS，采用ESI+模式，在适宜的质谱参数条件下，优化4个离子的传输电压和碰撞能量，分别筛选响应较高的2个离子为子离子，形成8组特征离子对，相应信息见表1。从而在MRM下，对40批花鹿茸、10批马鹿茸进行测定，以特征肽段为分析指标，建立了鹿茸药材的特征图谱，见图6。

表1 鹿茸特征肽段离子的相关信息

注：A.花鹿茸；B.马鹿茸；1.m/z 730.5(双电荷)→594.1，1 090.4；2.m/z 634.4(双电荷)→549.2，731.2；3.m/z 793.9(双电荷)→733.3，1 215.4；4.m/z 780.9(双电荷)→608.7，991.5。图6 鹿茸的特征图谱

3 总结与讨论

动物药材是中药的重要组成部分，被认为具有活性强、潜力大和应用广等优势。但是，与植物类中药相比，动物药材在鉴别和质量评价方面的研究发展缓慢、体系薄弱，特别是缺乏专属的鉴定指标与质量评价手段。

目前鹿茸的质量标准相对简单，只有鉴别项，且检测指标氨基酸成分缺乏专属性，无法对掺假的鹿茸品种进行鉴别；另外，多种成药使用鹿茸为原料，如“人参鹿茸丸”“鹿茸口服液”“鹿茸精注射液”等，由于质量标准中无专属性控制项目，导致含鹿茸原料的成药质量更加难以控制。

本研究将蛋白质酶切技术、液质联用技术及生物信息统计模型结合统计学分析方法应用于鹿茸特征多肽的分析，成功找到伪品鹿茸(驯鹿)的2个特征肽段，可用于正品鹿茸(梅花鹿、马鹿)中混有伪品鹿茸(驯鹿)样品的智能鉴别，该方法专属性好，很大程度上改善了目前鹿茸的质量评价方法。此法不仅可用于鹿茸药材的真伪鉴别，对于含鹿茸的成药或者动物药材的质量评价方法的开发也具有借鉴意义。梅花鹿与马鹿同为鹿科鹿属，两者物种亲缘关系较近，均为《中国药典》2020年版规定的“鹿茸”的基原。主成分分析结果表明，花鹿茸与马鹿茸不能进行有效区分。本研究虽未找到花鹿茸和马鹿茸的专属性特征肽段，但是基于特征肽段建立的特征图谱也具有一定的专属性，可用于鹿茸的定性鉴别，此外，特征肽段氨基酸序列的解析和确证是后期建立可用于定量测定的LC-MS/MS的基础，从而将伪品鹿茸的专属性特征肽段、鹿茸的特征图谱、以特征肽段为含量测定指标的LC-MS/MS统一形成鹿茸特征肽智能识别信息库，为鹿茸药材及相关制剂的质量控制和评价提供参考。