文拉法辛对抑郁模型大鼠抑郁症状的改善作用及对海马组织PI3K/Akt/mTORC1信号通路的影响

白天山，李志榕，黄 平，徐 烨，柳文华

近年来，伴随着人们生活节奏加快和生活压力增加，抑郁症已成为临床常见的情感障碍类精神疾病，严重影响人们的日常生活和身心健康[1]。研究显示，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)与抑郁、癫痫、阿尔茨海默病等多种神经系统疾病有关[2]，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)及蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)为mTOR上游中最主要的调控蛋白，并且提高PI3K/Akt/mTOR信号通路中Akt活性，可以有效地防止神经元程序性死亡[3-4]。文拉法辛(Wenfalasin)为5-羟色胺(5-HT)及去甲肾上腺素(NE)再摄取双重抑制药，是一种临床常用新型抗抑郁药物，目前对于其抗抑郁作用机制尚未完全阐明[5]。本研究拟建立孤养结合慢性刺激(CUMS)抑郁大鼠模型，观察文拉法辛对抑郁大鼠抑郁症状的改善作用效果及对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响，以期阐明文拉法辛抗抑郁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(SPF)级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，7～8周龄，体质量 200～225 g，购自北京维通利华生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2018-2-006。

1.2 药品与试剂 盐酸文拉法辛片(批号：100203)，规格：每片25 mg，购自常州四药制药有限公司。白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附实验(ELISA)测定试剂盒购自美国R&D公司。兔抗鼠PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)单克隆抗体购自美国Abcam公司，mTOR及磷酸化mTOR(p-mTOR)单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，β-actin内参及二抗购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 仪器 RIPA裂解液及BCA试剂盒购自美国Thermo公司；Morris水迷宫购自西班牙Panlab公司；组织切片机购自美国Thermo公司；BIO-R40型电泳槽及Kodak2000MM型电泳凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司；CX23光学显微镜购自日本Olympus公司；Eoipse Ti-s型倒置显微镜购自日本尼康公司。

1.4 实验方法

1.4.1 抑郁大鼠模型建立、分组及处理 60只健康雄性SD大鼠适应性喂养1周，随机分为对照组、模型组及文拉法辛低剂量组、文拉法辛中剂量组、文拉法辛高剂量组，每组12只。模型组与文拉法辛各剂量组大鼠均参照文献[6]方法以孤养结合慢性轻度不可预见刺激构建抑郁症大鼠模型，对照组正常饲养。主要应激包括：禁食禁水24 h、束缚3 h、夹尾1 min、电击足底(1 mA，20 s/min，30 min)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、热烘(45 ℃，5 min)、强光频闪3 h，除对照组外，其余各组大鼠每天随机给予1～2种不同刺激，连续刺激21 d，以出现饮水量显著降低、体质量减轻、毛色晦暗、探索行为减少等抑郁症状为建立模型成功。建模后文拉法辛低、中、高剂量组分别灌服15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg的文拉法辛，每日1次，对照组及模型组灌服等量的生理盐水，均连续给药3周。末次给药结束后1 h对所有大鼠进行行为学测试，完成后立即取材。

1.4.2 大鼠行为学观察

1.4.2.1 体质量 各组大鼠于试验结束后分别称量记录体质量。

1.4.2.2 旷场试验 各组大鼠于给药结束后进行旷场试验。按照文献[7]方法，在室内安静状态下，记录4 min内大鼠水平运动的格数及垂直竖立的次数(水平运动格数为大鼠穿越底面块数，垂直竖立次数为两前肢离开地面直立次数)，计算水平和垂直得分的总和即为其自主活动次数。

1.4.2.3 糖水偏好实验 各组大鼠于给药结束后分别进行基础糖水/纯水消耗试验。按照文献[8]方法，在适应性训练后，每只大鼠给予1瓶1%蔗糖水及1瓶纯水，1 h后记录大鼠总液体消耗量和糖水消耗量，糖水偏爱率(%)=糖水消耗量/总液体消耗量×100%。

1.4.3 大鼠学习与记忆功能 各组大鼠分别于给药结束后，采用Morris水迷宫测试检测其学习与记忆功能。按照文献[9]方法，分别对各组大鼠进行定位航行实验及空间探索实验，分别记录各组大鼠的逃避潜伏期时间(latency time)及目标象限记忆时间(memory time)。

1.4.4 海马神经元尼氏染色观察大鼠海马病理改变情况 各组大鼠分别于实验取材结束后，分离全脑并采用4%多聚甲醛溶液固定48 h，参考文献[10]的方法，切取大脑视交叉平面至横裂脑组织，随后进行常规脱水和石蜡包埋，切片后进行尼氏染色，光学显微镜下观察海马组织中尼氏小体及CA3区神经元。

1.4.5 ELISA检测海马组织中炎性因子的变化 实验结束后，各组大鼠均以断头法处死，采集其脑部海马区组织，准确称取各组大鼠海马组织，参考文献[11]的方法，于组织中加入预冷生理盐水并超声粉碎，4 ℃、5 000 g离心15 min后取上清液，0.22 μm滤膜过滤后，严格按照IL-6、IL-1β及TNF-α的ELISA测定试剂盒说明书操作步骤检测上述炎性因子的含量。

1.4.6 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测海马组织PI3K/Akt/mTORC1信号通路相关蛋白的变化 取上述1.4.5中各组大鼠剩余的海马组织，参考文献[12]的方法，制备组织匀浆液，提取组织总蛋白，4 ℃、5 000 g离心20 min，取上清，BCA试剂盒蛋白定量。随后常规上样、聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、封闭，随后加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR及β-actin一抗(1∶1 000)、辣根过氧化物酶标志兔抗鼠二抗(1∶2 000)，化学底物发光法显色，图像扫描分析，采用 Image-QuaNT软件测量其光密度，以各β-actin为内参对照分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠抑郁行为比较 与对照组比较，模型组大鼠体质量、糖水偏爱率及自主活动次数均明显降低(P<0.05)。与模型组比较，文拉法辛中剂量组、高剂量组体质量、糖水偏爱率及自主活动次数均明显升高(P<0.05)，文拉法辛低剂量组糖水偏爱率及自主活动次数明显升高(P<0.05)，但体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明文拉法辛能明显改善抑郁大鼠的抑郁行为学特征。详见表1。

表1 各组大鼠抑郁行为比较 (±s)

2.2 各组大鼠学习及记忆能力比较 与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期时间明显增加，目标象限记忆时间明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，文拉法辛各剂量组逃避潜伏期时间明显降低，目标象限记忆时间明显延长(P<0.05)，表明文拉法辛能改善抑郁大鼠的学习记忆能力。详见表2。

表2 各组大鼠学习及记忆能力比较(±s) 单位：s

2.3 各组大鼠海马组织尼氏染色结果 尼氏染色结果显示，对照组大鼠海马组织CA3区锥体细胞形态规则，排列紧密有序，并且胞浆内尼氏小体丰富。模型组大鼠海马CA3区锥体细胞形态不规则，排列疏松紊乱，神经元数量明显减少，并且细胞胞浆尼氏小体浅染甚至消失；在给予不同剂量的文拉法辛后，大鼠海马CA3区锥体细胞形态及神经元损伤均得到一定程度的改善。详见图1。

图1 各组大鼠海马组织尼氏染色结果(×400)

2.4 各组大鼠海马组织炎性因子含量比较 与对照组比较，模型组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6及TNF-α含量均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，文拉法辛中剂量组、高剂量组IL-1β、IL-6及TNF-α含量均明显降低(P<0.05)，文拉法辛低剂量组IL-6及TNF-α含量明显降低(P<0.05)，但IL-1β含量差异无统计学意义(P>0.05)，表明文拉法辛能降低抑郁大鼠海马组织中的炎性因子含量。详见表3。

表3 各组大鼠海马炎性因子含量比较 (±s) 单位：pg/mg

2.5 各组大鼠海马组织PI3K/Akt/mTORC1通路蛋白相对表达量比较 与对照组比较，模型组大鼠海马组织中PI3K、Akt、mTOR磷酸化蛋白与总蛋白比值均明显降低(P<0.05)。与模型组比较，文拉法辛中剂量组、高剂量组PI3K、Akt、mTOR磷酸化蛋白与总蛋白比值均明显增加(P<0.05)，文拉法辛低剂量组PI3K、mTOR磷酸化蛋白与总蛋白比值增加(P<0.05)，但Akt磷酸化蛋白与总蛋白比值差异无统计学意义(P>0.05)，表明文拉法辛能激活PI3K/Akt/mTORC1通路，上调相关通路蛋白的表达。详见图2、表4。

图2 各组大鼠海马组织中PI3K/Akt/mTORC1信号通路相关蛋白表达电泳图

表4 各组大鼠海马组织PI3K/Akt/mTORC1通路蛋白相对表达量比较(±s)

3 讨 论

抑郁症为一类常见的精神障碍性疾病，临床主要表现为情绪低落、行为迟缓、学习记忆下降、快感缺失、体质量减轻等症状，其发病机制至今未完全明确[13-14]。研究显示，长期慢性精神应激性刺激与抑郁症的发病密切相关，长期的慢性应激可引起脑部海马神经元的萎缩变性或死亡[15]。本研究结果显示，文拉法辛能明显改善慢性应激抑郁模型大鼠海马CA3区锥体细胞形态及神经元损伤，促进海马神经元细胞的数量增加，提高神经元的可塑性。旷场试验主要反映大鼠对新环境的探究情绪，表明其对环境的兴奋性和自主性；糖水实验主要反映大鼠对快感的缺失程度；Morris水迷宫实验利用大鼠厌水的天性来评价其学习记忆能力[16]。本研究结果显示，文拉法辛能改善抑郁模型大鼠体质量、糖水偏爱率及自主活动次数，降低逃避潜伏期及延长目标象限记忆时间，表明文拉法辛能够提高抑郁大鼠对周围事物的兴趣，增加进食量，改善学习记忆能力。

有研究发现，抑郁症病人外周和中枢的炎性细胞因子增多会导致免疫病理损害加强[17]，并且中枢神经递质代谢紊乱与中枢细胞因子紊乱有一定相关性[18]，表明文拉法辛改善海马组织的病理损伤可能与调节海马组织中炎性细胞因子有关。本研究结果显示，文拉法辛能明显降低模型组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6及TNF-α含量，表明大鼠在接受慢性应激刺激时诱导了免疫应答，促使炎性因子的分泌，文拉法辛能够改善抑郁大鼠因神经递质下降而导致细胞因子分泌异常的情况。

PI3K/Akt/mTORC1信号通路广泛存在于真核细胞中，mTORC1活性对于神经元的生长、分化和发育是必不可少的，抑制mTORC1通路活性可降低神经细胞活性，诱导神经元损伤[19]。研究显示，慢性不可预知性应激可导致大鼠海马组织中mTOR和Akt磷酸化蛋白表达下调，同时mTORC1信号通路缺陷易导致抑郁症的发生[20]。本研究结果显示，文拉法辛能上调PI3K、Akt、mTOR磷酸化蛋白与总蛋白比值，表明文拉法辛对PI3K/Akt/mTORC1信号通路具有明显的激活作用。

综上所述，文拉法辛可通过上调PI3K/Akt/mTORC1信号通路，减轻神经细胞凋亡，促进神经蛋白合成，诱导神经再生，改善神经元存活率，从而发挥显著的抗抑郁效果。