精源性卵母细胞激活因子的相关机制研究进展

纪丽轩 高玉平

上海交通大学医学院附属新华医院生殖医学中心（上海 200092）

通常认为卵母细胞在成熟分裂促进因子(maturation-promoting factor,MPF)和细胞生长抑制因子(cysostatic factor,CSF)的作用下，发育并停滞于第二次减数分裂中期，在精子或某些理化因素的刺激下卵母细胞才能恢复并完成减数分裂，这一过程称为卵母细胞激活（oocyte activation,OA）[1]。1990年，Swann等人通过将精子内提取物注射入卵母细胞内，并观察到受精成功的信号——钙离子振荡，首次提出关于“精子因子”的证据[2]。精源性卵母细胞激活因子（sperm-borne oocyte activation factor,SOAF）被认为是精卵质膜融合后，由精子向卵母细胞质内释放的一种或多种可溶性蛋白，可以启动信号转导通路，通过诱导钙离子振荡以达到激活卵母细胞的目的。目前广泛接受并唯一已明确的关键SOAF是磷脂酶C-zeta(phospholipase C zeta,PLCζ)[4]，已有多项研究证实，精子内PLCζ蛋白的缺乏、位置异常、活性及表达异常、相关基因突变与ICSI失败及男性不育相关[4]。但其后续激活钙离子振荡和卵母细胞激活的机制仍未完全阐明；同时，在部分文献中提出其他可能作为SOAF的候选蛋白，但目前仍存在争议。本文旨在对SOAF的可能候选蛋白及其相关作用机制进行总结。

一、卵母细胞激活与钙离子振荡

自20世纪70年代以来，钙离子波首先在爪蟾的卵母细胞中被报道[1]，随后通过钙离子敏感的荧光染色技术已经在包括猪，小鼠，牛等哺乳动物和人类的卵母细胞中分别探测到钙离子振荡。然而，钙离子振荡模式是具有物种特异性的，不同物种的卵母细胞内钙离子振荡波在振幅、持续时间以及频率上都存在差异[6-7]。目前在哺乳动物的受精过程中，卵母细胞内钙离子浓度的提高称为钙离子诱导钙释放过程（Ca+2-induced Ca+2 release，CICR process），目前主要依赖2种钙离子通道：三磷酸肌醇受体(inosital triphosphate receptors,IP3Rs)和Ryanodine受 体(Ryanodine receptors,RyRs)[1]。IP3Rs和RyRs都是钙离子依赖的双向调节通道，当细胞质内钙离子浓度升高，受体失活，钙离子被驱动回内质网（endoplasmic reticulum,ER）内储存，当细胞质内钙离子浓度回复到基础状态，则受体又被激活，重新开始驱动钙离子从内质网中释放。通过钙离子通道的双向调节，卵母细胞内才会维持长期持续的，呈周期性循环往复的钙离子振荡波[6]。虽然目前该机制仍未完全明晰，但由精子穿透进入卵母细胞后会触发CICR过程已被广泛接受。而当一个钙离子瞬变结束，钙离子回收进入储存钙离子的ER则包括一系列分子，包括基质相互作用分子1/2(Stromal-interaction molecules，STIM1/2)，Orai 1/2/3以及肌浆内质网Ca-ATP酶(Sarcoplasmic Reticulum Calcium ATPase,SERCA)，都在钙离子稳态中扮演重要角色。钙离子稳态可允许游离钙离子重新被储存到ER内，维持卵母细胞激活中钙离子振荡的循环往复[21]。钙离子波的振幅和频率则携带着一些可被探测到的信息，被细胞内的钙离子感应器所编码，并转换为细胞应答[1]。

第一个对由精子诱导人卵母细胞内钙离子振荡的直接研究是在1990年的早期进行的。Taylor CT等人[5]发现添加精子后的20-35分钟后即会出现钙离子振荡，而在受精过程中，从精子中释放的PLCζ1对于钙离子振荡的产生至关重要，首个钙离子波的振幅最高，达2.25uM，随后的钙离子波振幅随时间下降。在不同卵母细胞内钙离子的频率是不同的，在去除透明带的卵母细胞中，振荡的间歇是10分钟，而具有完整透明带的卵母细胞间歇是35分钟，持续时间约为4-5小时[1]。人工ICSI所诱导的钙离子振荡模式与内源性钙离子振荡相近，但在首个钙离子瞬变出现时间、钙离子波频率等参数有所不同。在体外人类卵母细胞激活相关报道中，第一个钙离子瞬变出现在ICSI之后的30到90分钟之间，随后以平均每小时2.4个钙离子瞬变的频率持续4-5小时[8]。

二、精源性卵母细胞激活因子

SOAF的首要条件即需触发卵母细胞胞质内持续的钙振荡，这一机制主要通过调节磷酸肌醇信号通路提高细胞内的三磷酸肌醇(1,4,5-trisphosphate，IP3）来实现。其次，SOAF的位置对于其功能来说也至关重要。精子头部位于顶体膜下方的区域称为核周鞘膜（perinuclear theca，PT），是一个菲薄的凝聚胞质蛋白层，可分为结构区和功能区。其中功能区又分为三个部分：顶体下区、赤道段和顶体后鞘核周囊(postacrosomal sheath-perinuclear Theca，PAS-PT)。SOAF就 容 纳 于PAS-PT区域中，当受精开始时，PAS-PT区域是第一个暴露于卵母细胞胞质的区域[9]。Kimura Y实验表明如果将精子细胞核周除PT外的所有精子质膜结构移除，精子则仍然可以保留激活卵母细胞的能力，进一步证实了SOAF位于精子头部的PT区[11]。第一个被认为是候选的SOAF是振荡素（oxcillin），但后续研究中向仓鼠卵母细胞内注射重组振荡素或其类似物人氨基葡萄糖-6-磷酸异构体均不能诱导激发钙离子，故目前认为该蛋白并不是一个SOAF[4]。近几年广泛的生化和临床证据提示主要的SOAF有2个蛋白，即PLCζ和顶体后WW结构域联合蛋白(WW domain-binding protein,PAWP)。其他可作为SOAF的候选蛋白也在部分文献中提出，但是否可明确为SOAF仍存在争议。

三、PLCζ

PLC蛋白家族在卵母细胞激活级联反应中发挥重要功能，故目前对于PLC蛋白家族的研究是目前关于卵母细胞激活的热点方向[4]。PLC蛋白可以催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯(phosphatidylinositol 4,5-biphosphate,PIP2)的水解，生成IP3和二酰甘油(diacylglycerol,DAG），并介导IP3与其受体结合，释放ER内储存的钙离子。细胞内钙离子水平的上升激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路，这一信号可被进一步诱导一系列细胞反应[1，4]。目前发现PLC蛋白家族有13个同工酶[12]。虽然该家族的多种亚型只在睾丸和精子中表达，但目前仅有证据表明PLCζ是一种SOAF。发现于2002年的PLCζ是PLC家族中最小的精子特异性PLC蛋白[4]，由于其分子结构特异性的缺少SH结构域和PH结构域，故只包含608个氨基酸，分子量仅为70kDa[13]。不像其他PLC蛋白，PLCζ对环境钙离子浓度十分敏感[4]，这与其结构和功能区域密切相关。PLCζ的结构由四个不同可调控的结构域构成：氮基端有4个串联的EF手型结构域（该区域内的EF3区对高浓度钙离子敏感，使得PLCζ与其他PLC亚型相区别）、蛋白中段有一个具有催化功能的核心X、Y结构域（可与PIP2结合，对于PIP2水解至关重要）和碳基端的一个C2结构域（可与磷脂膜上的PIP3结合）[14]。

四、PLCζ诱发卵母细胞激活的机制

PLCζ可催化细胞质内的PIP2水解为肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，由此诱发钙离子振荡，启动卵母细胞的激活。IP3随后可与其卵母细胞内质网上的IP3R受体结合，释放内质网内储存的钙离子。钙离子振荡激活卵母细胞内多种蛋白激酶，以一定的时间顺序激活受精所必须的下游事件。首先，DAG和被释放的钙离子将促进PKC的激活，PKC将磷酸化富含丙氨酸的豆蔻酰化蛋白激酶C的作用底物蛋白(myristoylated alanine-rich C kinase substrate MARCKS)，这些蛋白负责诱导皮质颗粒（cortical granule,CG）的胞吐，同时阻断多精子的进入。其次，细胞内钙离子水平的增加将激活钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)，CaMKII将早期有丝分裂抑制剂2(early mitotic inhibitor 2，Emi2)磷酸化。接下来，Emi2将被泛素-配体复合物降解，不再能抑制细胞分裂后期促进因子/环小体(anaphase-promoting complex/cyclosome,APC/C)的活性。活化的APC/C通过使保全素（securin）和细胞周期蛋白B1变性，导致卵母细胞内姐妹染色单体分离并解压缩，以促进第二极体排出，并通过将促成熟因子(maturation-promoting factor，MPF)降解使卵母细胞从第二减数分裂中释放出来。MPF由细胞周期蛋白B(cyclin B，CNB1)和细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)形成。APC/C可以特异性的靶向介导CNB1的退化。然而，最近有报道提示，为了降低MPF的水平并恢复细胞周期的进行，APC/C对CNB1的变性和另一个卵母细胞激酶Wee1样蛋白激酶2(Wee1-like protein kinase 2，WEE2)对CDK1的抑制都是必要的。最后，钙离子振荡可以使Mos/Mitogen激活的蛋白激酶(Mos/mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路失活，导致原核的形成[1,4,13,15]。

尽管有研究表明，在两种不同的PLCζ相关基因敲除的小鼠模型中，其精子可产生的子代数目减少，但这些PLCζ缺乏的精子仍然可以使卵母细胞受精，诱发相对减少、但足以激活卵母细胞的钙离子振荡。而因为原核形成延迟和多精受精提高[16-17]，在激活的卵母细胞中钙离子振荡的数量上升了70%。这些结果表明，在小鼠体内可能有另一个未知的SOAF，可以在缺乏PLCζ的条件下激活卵母细胞。这种未知的SOAF可以在IVF的过程中成功激活卵母细胞，但无法在ICSI过程中完成相同事件。未知的SOAF可以弥补PLCζ缺陷患者的一些病理过程，并可能成为药物制剂的新靶点，需要进一步研究。然而，人类精子中这种未知的SOAF尚未得到证实[18-19]。

五、PAWP

顶体后WW结构域结合蛋白(PAWP)，是一种碱性蛋白，具有WW结合区域的YGXPPX重复生物序列和一个N末端GRAM结构域，位于精子头部的核周基质中。2007年，Wu等报道了PAWP在牛、猪、猴和非洲爪蟾蜍卵母细胞,受精过程中可促进减数分裂恢复和启动原核发育。这一发现在几年后得到证实，当重组PAWP注入MII期卵母细胞可触发细胞内钙离子水平增加，而当向细胞内注射这种蛋白质的竞争性抑制剂，则可阻断细胞内钙离子释放和钙离子振荡[20-21]。同样的实验也在与人类和公牛的精子中得到验证[21-22]。此外，PAWP基因敲除小鼠的精子在IVF和ICSI处理后可以诱导卵母细胞内正常的钙离子振荡。尽管数据显示PAWP满足了所有成为SOAF的要求，然而，关于PAWP表达与钙离子振荡之间的关系目前仍未得到解释。一些研究者提出，PAWP的作用是通过其他蛋白质介导的，如YES相关蛋白，它可以激活PLCγ，随后激活下游的IP3信号通路[21]。Mehlmann等人利用外源生长因子表达刺激PLCγ途径，在小鼠卵母细胞中引发钙离子振荡[23]。然而，PAWP表达、PLCγ活性与钙离子振荡之间的关系无法证明。此外，由PAWP仅仅能诱发细胞内钙离子浓度升高，但细胞内的钙离子并不能呈现哺乳动物受精后特征性的钙离子振荡波。同时，考虑到PLCγ对钙离子也并不像PLCζ那样敏感，目前没有确凿的证据表明这种PLC同工酶PLCγ在卵母细胞活化中起着重要作用[4,24-25]。

六、其他可能的SOAF

目前除PLCζ，PAWP外，还有2个可能的SOAF因子，即非洲爪蟾蜍柠檬酸合酶同源物和被删除顶端的c-kit酪氨酸蛋白激酶受体(Truncated form of the c-kit tyro-sine kinase receptor,Tr-Kit)，但 目 前 这2种SOAF候选尚在动物模型实验阶段，人类精子相关实验仍需进一步探究。非洲爪蟾蜍柠檬酸合成酶同源物是一个45kDa的蛋白，作为SOAF它是有争议的，Harada等人发现其可以触发未受精的蝾螈卵母细胞内的钙离子振荡，同时如使用抗柠檬酸合酶抗体处理精子提取物后，其卵母细胞激活能力下降。目前尚无其在哺乳动物卵母细胞活化或受精过程中发挥功能的科学报道[25]。另一个SOAF候选物质为被删除顶端的c-kit酪氨酸激酶受体（Tr-kit）。虽然这种受体在哺乳动物受精中的作用尚不清楚，但它在精子头部的赤道区域表达，并在高质量精子中的顶体反应后持续存在[26-27]。

七、SOAF与卵母细胞激活失败

精子与卵母细胞融合后原核形成，在ICSI中，原核形成失败被视为受精失败的标志。目前ICSI可达到的受精率约为70~85%，临床工作中仍有1~5%会出现完全受精失败(totally fertilization failure,TFF)或受精率极低的情况发生[28]。TFF是指一次刺激周期中获取到的卵母细胞在ICSI后均无法形成原核，而卵母细胞激活失败(oocyte activation deficiency,OAD)是其最主要的原因[1]。精子因素，卵母细胞因素及人工因素均可引起OAD，而精子相关OAD则主要与SOAF的异常相关[13]。精子内PLCζ蛋白的缺乏，位置异常，活性、表达异常或基因突变都与ICSI失败或男性不育相关[4]，负责编码PLCζ的对应基因是位于第12号染色体上的PLCZ1基因（ENSG00000139151）,通过对临床中发生受精率低下或TFF的男性患者进行全外显子测序(whole exome sequencing,WES)的方式，截止目前为止，已有21个不同的突变基因被报道与受精率低下或TFF相关，包括EF-X连接区的1个错义突变（p.I120M），X催化结构域(p.V189C fs*12；p.C196*；R197H；p.L224P；p.H233L；p.L246F；p.L277P)和Y催化结构域(p.S350P；p.N377del；p.A384V；p.H398P；p.R412fs；p.P420L；p.K448N)共14个 突 变，X-Y连接区的2个移码突变(p.T324fs和p.V326K fs*25)和C2结构域的3个无义突变(p.I489F，p.S500L，p.R553P)和位于C端蛋白结构域外的一个无义突变（p.M578T）。所有突变都通过silico分析进行评估，大多数突变也进行了功能分析[38-48]，见表1。

表1 PLCZ1突变

文献 cDNA改变 外显子位点 蛋白质改变 结构域位置 突变类型 纯合性PLCζ表达水平及位置Silico分析 功能性分析[31] c.736C>T 7 p.L246F X 无义突变 纯合 表达降低位置改变 损伤 /[29] c.830T>C 7 p.L277P X 无义突变 双重杂合 表达降低 损伤 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母细胞后OA减弱HEK293T细胞中表达截短型蛋白质hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母细胞后OA减弱[28] c.[30] c.972_973delAG 9 p.T324 fs XY连接区 移码突变 双重杂合 / /972_973delAG 9 p.V326K fs*25 XY连接区 移码突变 杂合 与对照组无区别损伤截短型蛋白hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母细胞后受精率降低减弱[31] c.1048T>C 10 p.S350P Y 无义突变 纯合 表达降低位置改变 损伤 /[29] c.1129_1131deAAT 10 p.N377del Y 移码突变 双重杂合 表达降低 损伤 催化结构域裂解hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母细胞后OA失败[29] c.1151C>T 10 p.A384V Y 无义突变 纯合 表达降低 损伤 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母细胞后OA失败[35] c.1193C>A 11 p.H398P Y 无义突变 双重杂合 表达降低位置改变 损伤 hPLCZ1cRNA注射入小鼠卵母细胞后出现改变的钙离子模式[30] c.1234delA 11 p.R412fs Y 移码突变 双重杂合 / /HEK293T细胞中表达截短型蛋白质hPLCZ1cRNA注射入小鼠卵母细胞后OA减弱HEK293T细胞中表达降低hPLCZ1cRNA注射入小鼠卵母细胞后OA减弱[29] c.1344A>T 12 p.K448N Y 无义突变 双重杂合 表达降低 损伤 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母细胞后OA减弱[30] c.1259C>T 11 p.P420L Y 无义突变 双重杂合 / 损伤mPLCz1和hPLCZ1cRNA注 射入小鼠卵母细胞后出现改变的钙离子模式，OA减弱[28,33,37]c.1499C>T 13 p.S500L C2 无义突变 纯合/双重杂合[36] c.1465A>T 13 p.I489F C2 无义突变 纯合 PLCζ不表达 损伤无区别 损伤 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母细胞后受精率未受影响[38] c.1658 G>C 13 p.R553P C2 无义突变 纯合 与对照组与对照组无区别 损伤 hPLCZ1cRNA注射入小鼠卵母细胞后OA减弱，但与对照组无显著差别[29] c.1733T>C 14 p.M578T OD 无义突变 双重杂合 表达降低 损伤 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母细胞后OA失败

八、展望

目前对于SOAF仍有很大领域有待研究。对于已明确为SOAF的PLCζ，是否有未知的SOAF可以弥补PLCζ的缺陷，而对其相应的PLCZ1，基因筛选方式可以聚焦到PLCZ1序列上游的调控序列及内含子区域或者直接进行全基因组测序[13]。对于其他SOAF候选物质，PAWP诱发的钙离子振荡以激活卵母细胞具体分子机制有待明确，非洲爪蟾蜍柠檬酸合酶同源物质和Tr-Kit则需要进一步在人类精子上进行验证。