雪胆多酚抗氧化作用及对α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

赵 艳，刘丽娟，王白娟，陈 庚，高青青，张广辉，杨生超*

(1.云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室/西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，云南 昆明 650201; 2.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201; 3.云南农业大学机关党委，云南 昆明 650201)

【研究意义】雪胆(Hemsleyachinensis)为葫芦科雪胆属植物，主要分布于中国西南地区[1]。雪胆具有清热解毒、消炎抗菌等功效，被收载于《云南中草药》、《全国中草药汇编》，为民间习用药材，常用于治疗胃肠炎及急性扁桃体炎等疾病[2]。植物多酚是在植物体内广泛存在的次级代谢产物，具有较好的抑菌性和抗氧化活性[3-6]。有报道称在自然界中氨基酸也具有一定的抗氧化能力[7]。【前人研究进展】陈冠群等[8]测定氨基酸抗氧化活性的结果表明，蛋氨酸、赖氨酸和酪氨酸等6种氨基酸的抗氧化活性较高。天然抗氧化剂间存在相互增效协同的作用，Hwang等[9]研究发现高温不影响协同增效作用，生育酚和氨基酸具有联合抗氧化作用。但是对雪胆多酚与氨基酸之间的协同作用以及雪胆多酚对α-葡萄糖苷酶的研究尚未见报道。【本研究切入点】通过Folin-Ciocalte法测定多酚含量，结合DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子清除活性和铁还原能力法，探讨雪胆多酚与组氨酸、缬氨酸、甘氨酸之间的联合抗氧化活性，并采用体外法分析雪胆多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。【拟解决的关键问题】明确雪胆多酚与氨基酸的协同增效作用和对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，为雪胆的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料：雪胆(Hemsleyachinensis)采自云南柯兆生物科技有限公司雪胆种植基地，由杨生超教授鉴定为葫芦科雪胆属雪胆(Hemsleyachinensis)，经粉碎过100目筛，密封于干燥器中备用。

试验仪器：无水乙醇、苯酚、葡萄糖购自天津市风船化学试剂科技有限公司；氯仿、正丁醇、浓硫酸购自重庆川东化工有限公司；冰醋酸、氢氧化钠、硫酸亚铁、水杨酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁粉购自西陇化工股份有限公司，福林-酚试剂、甘氨酸、组氨酸、缬氨酸购自国药集团化学试剂有限公司，对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)购自上海金穗生物科技有限公司，对硝基苯酚购自西陇化工有限公司，α-葡萄糖苷酶购自Sigma公司，ABTS购自化工生物工程(上海)股份有限公司，以上试剂均为国产分析纯。DPPH购自Sigma公司。722S型可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)、DRHH-型数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)、DC-600高速多功能粉碎机(江武义鼎藏日用金属制品厂)、电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 雪胆多酚的提取 雪胆块茎→粉碎机粉碎(100目)→提取→过滤→雪胆多酚提取液[10]。

1.2.2 没食子酸标准曲线的制作 准备没食子酸标品，根据Folin-Ciocalte法在765 nm处测定提取液的吸光值，平行测定3次。以没食子酸浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制没食子酸的标准工作曲线。

1.2.3 雪胆多酚提取率的计算 将1.2.2中没食子酸标准溶液用10 mL雪胆多酚提取液替代，按1.2.2步骤测定吸光值，通过没食子酸标准工作曲线的线性方程，得到多酚浓度后通过式(1)，计算雪胆多酚提取率。

(1)

式中，C：多酚浓度(mg·mL-1)；Va：容量瓶量程(mL)；Vb：提取液总体积(mL)；M：样品质量(g)；V：取液量(mL)。

1.2.4 雪胆多酚与氨基酸的体外联合抗氧化能力 取4 g雪胆粉末进行多酚提取，并计算雪胆多酚的含量，将雪胆多酚提取液按0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg·mL-1浓度梯度进行稀释。分别按照前述浓度梯度配制抗坏血酸(Vc)、甘氨酸、组氨酸和缬氨酸溶液。

(1)DPPH清除率的测定。雪胆多酚提取液、组氨酸、缬氨酸、甘氨酸、Vc(分别取2 mL于试管中)→DPPH无水乙醇溶液(2 mL)→室温反应(0.5 h)→测定吸光值A1(517 nm)→以水代替待测溶液测定吸光值A0，以乙醇溶液代替DPPH溶液测定吸光值A2，以同等梯度浓度抗坏血酸溶液作对照→计算DPPH清除率[11]。

联合抗氧化测定中，氨基酸与雪胆多酚提取液各1 mL，用等浓度乙醇置换作对照组和空白组。

(2)

(2)ABTS清除率的测定。配制ABTS溶液。雪胆多酚提取液、组氨酸、缬氨酸、甘氨酸、Vc(分别取2 mL于试管中)→ABTS溶液(1.8 mL)→避光反应(0.5 h)→测定吸光值A1(734 nm)→以水代替待测溶液测定吸光值A0，以乙醇溶液代替ABTS溶液测定吸光值A2，以同等梯度浓度抗坏血酸溶液作对照→计算ABTS清除率[12]。

联合抗氧化测定中，氨基酸与雪胆多酚提取液各1 mL，将ABTS和雪胆多酚溶液、氨基酸、氨基酸与雪胆多酚混合液用等量蒸馏水置换作对照组和空白组。

(3)

(3)羟基自由基清除率的测定。雪胆多酚提取液、组氨酸、缬氨酸、甘氨酸、Vc(分别取2 mL于试管中)→硫酸亚铁(2 mL)→过氧化氢(2 mL)→室温反应(2 min)→水杨酸钠溶液(2 mL)→室温反应(20 min)→测定吸光值A1(510 nm)→以水代替待测溶液测定吸光值A0，以水代替过氧化氢溶液测定吸光值A2，以同等梯度浓度抗坏血酸溶液作对照→计算羟基自由基清除率[13]。

联合抗氧化测定中，氨基酸与雪胆多酚提取液各1 mL，用等量蒸馏水代替水杨酸钠溶液和雪胆多酚溶液、氨基酸、氨基酸与雪胆多酚混合液作对照组和空白组。

(4)

(4)超氧阴离子清除率的测定。雪胆多酚提取液、组氨酸、缬氨酸、甘氨酸、Vc(分别取2 mL于试管中)→邻苯三酚溶液(1 mL)→Tris-HCl溶液(4.5 mL)→25℃水浴(10 min)→HCl溶液(1.5 mL)→测定吸光值A2(360 nm)→以水代替待测溶液测定吸光值A1，以同等梯度浓度抗坏血酸溶液作对照→计算超氧阴离子清除率[14]。

联合抗氧化测定中，氨基酸与雪胆多酚提取液各1 mL，将邻苯三酚溶液和雪胆多酚溶液、氨基酸、氨基酸与雪胆多酚混合液用等量蒸馏水置换作对照组和空白组。

(5)

(5)还原能力的测定。雪胆多酚提取液、组氨酸、缬氨酸、甘氨酸、Vc(分别取2 mL于离心管中)→磷酸缓冲溶液(2.5 mL)→K[Fe(CN)]6溶液(2.5 mL)→室温反应(20 min)→三氯乙酸溶液(2.5 mL)→离心取上清液(5 mL)→三氯化铁(0.5 mL)→蒸馏水(5 mL)→室温反应(20 min)→测定吸光值(700 nm)[15]。

联合抗氧化测定中，氨基酸与雪胆多酚提取液各1 mL。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶活性抑制实验 (1)pNP标准曲线的制作。配制pNP标准溶液，在405 nm处测定吸光值，以pNP浓度和吸光值为横纵坐标，绘制pNP标准曲线[16-17]。

(2)适宜酶量的确定。pNPG溶液(1 mL)→α-葡萄糖苷酶液(同浓度不同量)→磷酸缓冲溶液(补充至同体积)→37 ℃水浴→每隔10 min Na2CO3溶液终止反应(2 mL)→测定吸光值(405 nm)[18-19]。

(3)酶反应动力学方程的建立。pNPG溶液(同量不同浓度)→α-葡萄糖苷酶液(0.4 mL)→磷酸缓冲溶液(补充至同体积)→37 ℃水浴(0.5 h)→Na2CO3溶液终止反应(2 mL)→测定吸光值(405 nm)[18-19]。对照组用磷酸缓冲溶液置换α-葡萄糖苷酶液。

(4)对α-葡萄糖苷酶抑制作用的动力学实验。10支试管(分为两组)→α-葡萄糖苷酶液(同量不同浓度)→雪胆多酚提取液(1 mL)→磷酸缓冲溶液(补充至同体积)→37 ℃水浴(预反应30 min)→pNPG溶液(1 mL) →37 ℃水浴(30 min)→Na2CO3溶液终止反应(2 mL)→测定吸光值(405 nm)。

(5)对α-葡萄糖苷酶抑制类型的确定。8支试管(分为两组)→α-葡萄糖苷酶溶液(0.4 mL)→磷酸缓冲溶液(1组为1、0.8、0.6、0.4 mL，2组为2、1.8、1.6、1.4 mL)→37 ℃水浴(预反应30 min)→pNPG溶液(1 mL) →37 ℃水浴(30 min)→Na2CO3溶液终止反应(2 mL)→测定吸光值(405 nm)。用磷酸缓冲溶液代替α-葡萄糖苷酶液做对照组。

1.3 数据分析与作图

采用Microsoft Excel 2013整理数据作图，以SPSS 20.0中的LSD法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线的建立

以没食子酸浓度与吸光值为横纵坐标绘制标准曲线。得到没食子酸标准曲线的回归方程：Y=67.23X+0.0046，R2=0. 9997。由图1表明，在0～0.009 mg·mL-1没食子酸浓度与吸光值线性关系良好。

2.2 雪胆多酚与氨基酸的联合体外抗氧化实验

2.2.1 清除DPPH自由基能力分析 由图2可知，随着雪胆多酚提取液、组氨酸、组氨酸与雪胆多酚混合液、缬氨酸、缬氨酸与雪胆多酚混合液、甘氨酸、甘氨酸与雪胆多酚混合液浓度的不断提高，DPPH自由基清除率也呈现增加的趋势。结果表明其IC50值分别为0.0018、0.0068、0.0056、0.0036、0.0094、0.0076、0.0066、0.0005 mg·mL-1。通过IC50数值的大小，可以发现抗氧化能力的差异，总体趋势为IC50数值越小，对应物质的抗氧化能力越强。结果表明，雪胆多酚、3种氨基酸、3种氨基酸和雪胆多酚联合使用对DPPH有一定的清除能力，但清除能力略弱于Vc。

2.2.2 清除ABTS自由基能力分析 由图3可知，随着各溶液浓度的增加，ABTS自由基的清除率也在逐渐增大。研究结果表明，各溶液IC50的数值分别为雪胆多酚提取液0.0058 mg·mL-1、组氨酸0.01 mg·mL-1、组氨酸与多酚混合液0.0016 mg·mL-1、缬氨酸0.0082 mg·mL-1、缬氨酸与多酚混合液0.0017 mg·mL-1、甘氨酸0.15 mg·mL-1、甘氨酸与多酚混合液0.0017 mg·mL-1、Vc溶液0.0007 mg·mL-1。结果表明，雪胆多酚、3种氨基酸、3种氨基酸和雪胆多酚联合使用对ABTS自由基有一定的清除能力，但清除能力略弱于Vc。

2.2.3 清除羟基自由基能力分析 雪胆多酚、3种氨基酸、3种氨基酸和雪胆多酚联合使用对羟基自由基均具有清除能力，但清除能力弱于Vc(图4)。随着各个溶液浓度增加，羟基自由基的清除率增强，结果表明IC50的数值分别为雪胆多酚提取液0.0032 mg·mL-1、组氨酸0.0017 mg·mL-1、组氨酸与多酚混合液0.0018 mg·mL-1、缬氨酸0.0017 mg·mL-1、缬氨酸与多酚混合液0.0018 mg·mL-1、甘氨酸0.0028 mg·mL-1、甘氨酸与多酚混合液0.0018 mg·mL-1和Vc 0.0012 mg·mL-1。

2.2.4 清除超氧阴离子能力分析 由图5可知，与Vc清除超氧阴离子能力比较，雪胆多酚、3种氨基酸、3种氨基酸与雪胆多酚联合使用对超氧阴离子均具有一定的清除能力。结果表明，IC50的数值分别为雪胆多酚提取液0.0075 mg·mL-1、组氨酸0.011 mg·mL-1、组氨酸与多酚混合液0.0044 mg·mL-1、缬氨酸0.016 mg·mL-1、缬氨酸与多酚混合液0.0027 mg·mL-1、甘氨酸0.017 mg·mL-1、甘氨酸与多酚混合液0.008 mg·mL-1和Vc 0.0018 mg·mL-1。

2.2.5 还原能力分析 由图6可知，雪胆多酚、氨基酸均具有一定的还原能力，随着雪胆多酚提取液、组氨酸、组氨酸与多酚混合液、缬氨酸、缬氨酸与多酚混合液、甘氨酸、甘氨酸与多酚混合液和Vc浓度的增加，还原能力也逐渐增大，但还原能力较Vc稍弱。

2.3 雪胆多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制实验

2.3.1 建立pNP标准曲线 以pNP浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制pNP标准曲线。Y=64.179X+0.0001为线性回归方程(R2=0.9997)。从图7可知，pNP浓度在0～0.004 mmol·L-1内pNP浓度与吸光值线性关系良好。

2.3.2 α-葡萄糖苷酶反应动力学中最适酶量的测定 由图8可知，α-葡萄糖苷酶溶液用量越大，线性反应期的时间缩短。根据初始反应速率的数值，确定酶的用量为0.4 mL，选取0.5 h作为反应时间，进行酶反应动力学测定。

2.3.3 酶反应动力学方程的确定 由图9可知，直线的X轴截距为=-0.18，Y轴的截距为3.08。因为X轴的截距=-1/Km，Y轴截距=1/Vmax。

米氏常数Km=5.56 mg·mL-1

最大反应速率Vmax=0.32 nM·min-1

将米氏常数与最大反应速率代入酶反应动力学方程，可得到米氏方程。

V=Vmax[S]/ ([S]+Km) =0.32 nmol/L·min-1[S]/([S]+5.56 mg·mL-1)

2.3.4 雪胆多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制类型 有无抑制剂的体系速率直线均经过原点，从动力学曲线可以看出，当有抑制剂时，速率直线的斜率较小，从图10可以判断雪胆多酚提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用属于可逆性抑制类型。

竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制属于可逆性抑制中的3种类型。当最大反应速率不变、米氏常数增大时为竞争性抑制类型；当最大反应速率减小、米氏常数不变时为非竞争性抑制类型；当最大反应速率和米氏常数的数值都减小时属于反竞争抑制类型。由图11可知，添加抑制剂后，体系的最大反应速率和米氏常数均呈现减小的趋势，由此可知雪胆多酚对α-葡萄糖苷酶是可逆性抑制中的反竞争性抑制类型。

3 讨 论

酚类抗氧剂一般含有一个或多个酚羟基，羟基能提供氢质子与自由基反应，起到清除自由基的作用[20]。雪胆多酚提取液清除DPPH的能力较强，其 IC50为0.0018 mg·mL-1；并有一定的羟基自由基、ABTS、超氧阴离子清除作用。组氨酸、缬氨酸与甘氨酸清除羟基自由基的能力较强，其IC50分别为

0.0017、0.0017、0.0028 mg·mL-1；并具有一定的DPPH、ABTS、超氧阴离子清除作用。雪胆多酚提取液分别与组氨酸、缬氨酸、甘氨酸联合使用清除ABTS的能力较强，其IC50分别为0.0016、 0.0017、0.0017 mg·mL-1；并具有一定的DPPH、羟基自由基、超氧阴离子清除作用。

天然抗氧化剂间可能存在协同作用，常将两种以上的天然抗氧剂联合使用。氨基酸具有一定的抗氧化活性，但与酚类、黄酮类、维生素类强氧化剂相比，氨基酸的抗氧化活性相对较小，而氨基酸能发挥其抗氧化活性的作用的机制之一，是与其他抗氧化剂发挥协同抗氧化的作用[21]。李新[22]研究了20种氨基酸与9种酚类及维生素抗氧化剂的联合作用效果，发现组氨酸等氨基酸与9种酚类及维生素抗氧化剂之间存在较为明显的ABTS自由基清除活性的协同作用。

α-葡萄糖苷酶可水解α-1,4糖苷键，把机体摄入的碳水化合物生成利于吸收的葡萄糖，在人体糖类化合物代谢中有着重要的作用，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以竞争性抑制α-葡萄糖苷酶，从而减弱及减缓葡萄糖在肠道中的吸收。通过雪胆多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学曲线类型研究，发现雪胆多酚对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，属于可逆性抑制中的反竞争性抑制类型。不同多酚化合物的抑制类型有所不同，伍城颖等[23]研究发现芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为竞争性抑制。宋菲等[24]研究了槟榔提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，结果表明槟榔壳及槟榔籽提取物对酶活性的抑制作用类型为竞争与非竞争的混合型抑制，而槟榔花提取物对酶活性的抑制作用类型为竞争与反竞争的混合型抑制。

4 结 论

利用体外抗氧化评价方法，分析了雪胆多酚与组氨酸、缬氨酸、甘氨酸单独抗氧化和组合抗氧化效应实验结果表明，雪胆多酚、组氨酸、缬氨酸、甘氨酸、组氨酸与雪胆多酚联合、缬氨酸与雪胆多酚联合、甘氨酸与雪胆多酚联合均具有清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子清除活性的能力，并具有一定的还原能力。通过动力学实验发现，雪胆多酚对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，对酶活性的抑制作用类型为可逆性抑制中的反竞争性抑制类型。本研究结果表明，雪胆多酚提取物具有良好的开发潜力，为提高雪胆产品的附加值和雪胆资源的高效利用提供了理论依据。