大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS克隆及非生物胁迫表达分析

邱 爽，张 军，何佳琦，周雨明，李铭杨，翟 莹*

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161005；3.吉林中智九方咨询有限公司，吉林 长春 130000)

【研究意义】植物在遭受不良环境条件后，可以诱导合成大量渗透调节物质来增加植物细胞的渗透压，提高植物抵抗胁迫的能力，从而维持植物自身的代谢和生长发育。其中棉子糖系列寡糖(Raffinose family oligosaccharides, RFOs)就是这些渗透调节物质的典型代表，它们是高等植物中含量仅次于蔗糖的一类可溶性糖。肌醇半乳糖苷合成酶(Galactinol synthase, GolS)是RFOs生物合成途径中的关键酶[1]。大豆作为一种重要的经济作物，其GolS基因的功能鉴定对于大豆RFOs代谢途径及大豆抗逆机制的研究都具有重要意义。【前人研究进展】目前已有大量关于GolS基因受逆境胁迫诱导表达的报道，且超量或异源表达该基因可以不同程度的提高转基因植物的抗逆性。拟南芥中含有7种GolS基因，其中AtGolS1和AtGolS2可以被干旱和高盐胁迫诱导上调表达，AtGolS3可以被低温胁迫诱导上调表达[2]。AtGolS1与AtGolS2过表达转基因植株中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量均增加，对氧化胁迫的耐受能力增强[3]。将AtGolS2在水稻中异源表达还可以提高转基因水稻在干旱胁迫下的产量[4]。小麦TaGolS3的表达受外源脱落酸、低温和盐胁迫的诱导，同时还能被ZnCl2和CuCl2所诱导，通过对活性氧的调控，转基因植株表现出对锌胁迫的耐受性[5]。GolS基因表达的调控机制较为复杂，目前已发现多种植物转录因子可以调控其表达，例如HSF、DREB和WRKY等[6-8]。但到目前为止，有关大豆中肌醇半乳糖苷合成酶的研究非常少见。【本研究切入点】本研究克隆了一个大豆GolS基因GmGolS，并对其非生物胁迫下的表达量进行检测。【拟解决的关键问题】此研究为GmGolS基因在大豆抗逆基因工程育种中的进一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 基因的克隆

在NCBI(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)中获得一个功能未被鉴定的大豆GolS基因mRNA序列(Genebank登录号：NM001251098)。使用RNAiso Plus试剂(Takara)提取大豆叶片总RNA，使用cDNA反转录试剂盒(Novoprotein)合成第一链cDNA。根据GmGolS基因开放阅读框(ORF)序列设计引物，上游引物为5′-GGAATTCCATATGATGGCTCCTAATATCACCACTG-3′，下游引物为5′-GGAATTCTTAAGCAGCAGATGGGGC-3′(其中下划线部分分别代表限制性内切酶位点NdeI和EcoR I)，以第一链cDNA为模板扩增基因的全长ORF序列。PCR反应程序设置为94 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，此步骤进行30个循环；72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物连接至克隆载体pMD18-T(Takara)并转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性菌落扩繁并提取质粒，经NdeI 和EcoR I对质粒进行双酶切，阳性质粒送上海生工公司测序鉴定。

1.2 生物信息学分析

蛋白的分子量和等电点使用在线软件ExPASy(http://expasy.org/tools/pi_tool.html)进行预测；蛋白的亚细胞定位使用在线软件PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)进行预测；在NCBI数据库(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)搜索植物GolS基因；蛋白系统进化树使用MEGA5.0软件进行构建。

1.3 非生物胁迫处理

在25 ℃培养室内，配制Hoagland营养液水培大豆幼苗，光照条件为16 h光照/8 h黑暗。待大豆幼苗的第一片三出复叶完全展开时，进行非生物胁迫处理：将大豆幼苗置于含15 % PEG8000的营养液中模拟干旱胁迫；将大豆幼苗置于含150 mmol/L NaCl的营养液中进行高盐胁迫；将大豆幼苗置于4 ℃培养箱中进行低温胁迫。分别在处理的0(即未处理)、1 、2 、5 、10 和 24 h 剪取0.1 g 第一片三出复叶，迅速置于液氮中，-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.4 实时荧光定量PCR

使用RNAiso Plus试剂(Takara)提取上述各样本的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和OD260/280值检测提取的RNA质量。使用cDNA反转录试剂盒(Novoprotein)合成第一链cDNA。根据GmGolS基因ORF序列设计实时荧光定量PCR引物。上游引物为5′-TCTAAGCCTTGGAGGTACACTGG-3′，下游引物为5′-GGCACGGACGAACTTGACTTC-3′。选择大豆组成型表达基因β-Tubuin(GenBank登录号：GMU12286)作为内参基因(F：5′-GGAAGGCT TTCTTGCATTGGTA-3′，R：5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′)。在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR仪上，对GmGolS基因在非生物胁迫下的表达量进行检测。实时荧光定量PCR反应体系如下：2×TB Green Premix ExTaqⅡ(Takara) 10 μl、cDNA 2 μl、上下游引物各0.8 μl，补水至20 μl。反应程序如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，40个循环。所有处理均做3次重复，采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 GmGolS基因的克隆

如图1所示，从大豆叶片cDNA中扩增获得一条大约1000 bp的条带，与NCBI数据库中公布的GmGolS基因序列(987 bp)大小相符合。将其连接克隆载体pMD18-T(图1)，经测序验证，扩增所得产物正是GmGolS基因。

2.2 GmGolS序列及进化分析

由图2显示，GmGolS基因ORF全长987 bp，编码328个氨基酸，分子量38.03 kDa，等电点5.79。GmGolS蛋白含有一个保守的锰离子结合序列DXD，一个相对保守的丝氨酸磷酸化位点及一个C末端疏水性的五肽结构APSAA，这些都是植物GolS的典型特征[10-11]。亚细胞定位预测结果显示，GmGolS蛋白定位于细胞的叶绿体和/或细胞质中。

将GmGolS蛋白氨基酸序列与其他植物中的13个GolS蛋白氨基酸序列进行进化分析。由图3显示，GmGolS蛋白与沙冬青AmGolS蛋白的亲缘关系最近，其次与玉米ZmGolS1蛋白也具有比较近的亲缘关系，与拟南芥AtGolS蛋白和小麦TaGolS蛋白的亲缘关系最远。

2.3 GmGolS在非生物胁迫下的表达

大豆幼苗经干旱、高盐和低温胁迫处理后，利用实时荧光定量PCR对GmGolS的表达动态进行检测。结果显示：干旱处理后，GmGolS被诱导表达且响应最为明显，在处理后2 h 达到最大值，是对照0 h的155倍(图4-A)；高盐和低温处理后，GmGolS也被诱导表达，但表达量的升高均不超过对照的10倍(图4-B和4-C)。由此推测GmGolS可能主要在大豆应对干旱胁迫时发挥功能。

3 讨 论

RFOs代谢途径与植物生长发育及植物抗逆性之间关系密切。GolS是RFOs生物合成起始的关键限速酶，它通过催化UDP-半乳糖和肌醇反应合成肌醇半乳糖苷，再以此为供体，在棉籽糖合成酶和水苏糖合成酶的作用下将蔗糖合成棉籽糖和水苏糖等寡糖[12]。这些可溶性糖不仅可以作为细胞中的渗透调节物质，还可以作为植物适应环境的信号物质[13]。

GolS属于多基因家族，仅在拟南芥中就发现了10个编码GolS的基因[14]，大豆中也含有多个GolS基因(后续会另文发表)。不同GolS基因在植物应对胁迫时的功能不尽相同[2, 15]，即不同的GolS基因可以被不同的逆境条件所诱导，同一逆境又可以同时诱导多种GolS基因的表达，所以不同的GolS基因的抗逆性也存在交叉[16]。但不同物种间的GolS具有很高的相似性，它们都具有一个对于GolS酶活至关重要的锰离子结合序列DXD[17]，一个相对保守的丝氨酸磷酸化位点及一个C末端疏水性的五肽结构APSAA。亚细胞定位的不同可能意味基因功能上会存在差异。GmGolS蛋白可能定位于叶绿体和/或细胞质中，这与前人研究结果相符[18]。

基因表达量检测结果显示，GmGolS对干旱胁迫的应答要明显强于对高盐和低温胁迫的应答，是一个典型的干旱诱导型基因，推测其可能在大豆抗旱生理中起到重要作用。前人也报道了大量GolS提高转基因植物抗旱性的研究。例如在水稻中超表达拟南芥AtGolS2使转基因水稻耐旱能力显著提高[4]；在烟草中超表达牛耳草BhGolS1同样使转基因植株耐旱能力显著提高[19]。玉米ZmGolS2受干旱胁迫诱导且能提高转基因拟南芥的耐旱性，研究发现其启动子上存在2个脱水响应元件DRE，ZmDREB2A可以与其中一个DRE元件结合从而上调ZmGolS2的表达[20]。而本研究中的GmGolS基因上游是否也存在转录因子的调控，其具体的调控机制如何，还有待进一步研究。

4 结 论

本研究从大豆中扩增得到编码GolS的基因GmGolS。其ORF全长987 bp，编码328个氨基酸，分子量38.03 kDa。GmGolS蛋白与沙冬青AmGolS蛋白的亲缘关系最近。干旱、高盐和低温胁迫均可诱导GmGolS的表达，且GmGolS对干旱胁迫的响应最为明显。