燕麦SCoT分子标记体系的优化及引物筛选

李 进，陈仕勇

(1.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041；3.四川省抗逆牧草种质创新及生态修复工程实验室，四川 成都 610041)

【研究意义】燕麦(AvenasativaL.)是世界各地广泛种植的一种重要的一年生粮饲兼用作物，具有抗旱、耐冷、耐瘠薄等优良性状和较高的营养及保健价值[1]。燕麦主要分布在北半球的温带地区，国内主要种植省区为河北、内蒙古、山西，其次是甘肃、宁夏、陕西、青海及四川等，特别在我国青藏高原地区是冬春重要的饲草来源[2]。目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism, SCoT)分子标记是一种针对ATG起始密码子及侧翼序列保守性开发的新型目的基因分子标记，该技术较其他分子标记具备操作简便、多态性高、遗传稳定性好和成本低等优势。通过优化建立燕麦SCoT-PCR反应的最优体系，为SCoT分子标记技术在燕麦中的应用以及燕麦品种的保护、新品种的选育等提供重要的工具。【前人研究进展】国内对于燕麦的研究主要集中在高产栽培管理技术研究、抗性生理研究[3]、遗传育种研究[4-5]等。目前，随着分子遗传标记技术的广泛应用，已有多种分子标记技术在燕麦种质资源评价及育种中应用。如基于内部简单重复序列(ISSR)[6]、随机扩增多态性 DNA 标记(RAPD)[7]、相关序列扩增多态性标记(SRAP)[8]等分子标记技术揭示了燕麦种质资源间的遗传变异，但不同的分子标记手段都有各自的优缺点并能达到互补的作用[9]。自Collard和Mackill[10]开发了SCoT分子标记以来，已有多种植物的 SCoT-PCR反应体系被建立或优化[11]。目前已在牧草和饲用作物上得到了较好的应用，如紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、鸭茅(DactylisglomerateL.)等[12]。【本研究切入点】目前燕麦种质资源的评价和育种落后于其他栽培作物，特别是关于种质的评价和精准鉴定等方面，因此开展不同类型的分子标记在燕麦种质资源研究中非常有必要。本研究采用正交试验设计方法对SCoT-PCR反应体系进行优化，并筛选了80条SCoT引物在供试燕麦中进行多态性筛选和退火温度的确定。【拟解决的关键问题】建立燕麦SCoT-PCR反应的最优体系，筛选出在不同燕麦品种中扩增多态性较好的引物，并确定其最佳的退火温度，为燕麦SCoT分子标记技术的应用提供重要的参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究选用青引1号、青引2号、苏联燕麦、青燕1号4个品种进行PCR体系优化和引物筛选，本研究中的供试材料种子均来自四川省抗逆牧草种质创新及生态修复实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测 将供试燕麦种子于花盆中播种，待燕麦幼苗长出后，随机采集每个品种不少于20株的鲜嫩叶片混合，采用试剂盒DP305(北京天根)提取DNA，用Nanodrop测定其DNA浓度和纯度，并用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，模板DNA保存在-30 ℃的冰箱冷冻备用。

1.2.2 SCoT-PCR退火温度的确定与目标引物的筛选 本研究引物选用Collard和Mackill[10](SCoT1～SCoT36) 及Luo等[13](SCoT37～SCoT80)开发的SCoT引物，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR扩增反应在BIO-RAD T100 Termal Cycler PCR仪上进行，扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min；退火1 min(设置8个退火温度梯度分别为54、53.5、52.8、51.7、50.3、49.1、48.4、48 ℃)；72 ℃延伸1.5 min；共34个循环；72 ℃延伸10 min；最后置于4 ℃冰箱冷藏备用。扩增反应结束后采用 1.3 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，拍照保存并分析各个引物扩增效果。

1.2.3 SCoT-PCR的正交试验设计 在引物退火温度筛选的基础上，随机选取引物用于确定适宜的2×EsTaqMaster Mix(北京康为世纪生物)、DNA模板与引物的用量，反应中各个因素水平如表1所示，L9(33)正交设计具体信息如表2所示，试验所用样本DNA浓度为10 ng·μl-1，引物浓度为10 μmol·μl-1。

表1 燕麦SCoT-PCR反应体系各因素水平

表2 PCR反应因素水平的L9(33)正交设计方案

1.2.4 SCoT-PCR扩增 PCR反应体系总体积为20 μl，不足部分用ddH2O补足，将反应产物在1.3 %琼脂糖凝胶上进行检测，选用D2000作为电泳Marker。对各体系扩增效果进行对比，以选取最佳反应体系。

1.2.5 反应体系的验证 以四川省抗逆牧草种质创新及生态修复实验室栽培的其他12个品种燕麦DNA为模板(陇燕3号、陇燕4号、陇燕5号、燕王、骏马、牧王、锋利、边锋、牧乐思、领袖、梦龙、莫妮卡)，随机选取能扩增出清晰可辨且完整条带的引物验证反应体系的可靠性及退火温度的准确性，并用1.3 %琼脂糖凝胶电泳检测试验结果。

2 结果与分析

2.1 退火温度筛选

引物退火温度是影响PCR反应的重要因素，在前期实验的基础上本试验确定了在48～54 ℃退火温度范围进行最佳温度的筛选。在不同退火温度条件下，引物的扩增效果存在一定的差异(图1)，主要表现在条带数量、亮度及清晰程度等方面。这也说明有必要对筛选的引物进行退火温度的优化。SCoT57引物的退火温度筛选中，当退火温度设置为51.7 ℃时，扩增条带清晰且完整，而退火温度小于或大于51.7 ℃时扩增出来的条带不够清晰和完整。

2.2 引物筛选

本试验选用4个供试燕麦品种对80条SCoT引物的扩增效果及多态性进行了筛选和评价。其中65条引物能扩增出清晰可辨且完整的条带，占供试引物的81.25 %，每条引物扩增条带数为2～14条，其中36条引物能扩增出清晰且丰富的多态性条带(表3)，占供试引物的45 %。

表3 SCoT引物序列

续表3 Continued table 3

2.3 燕麦SCoT反应体系的正交试验分析

不同正交组合处理的扩增效果存在差异(图2)，如主带的亮度、扩增条带的清晰程度等。处理5的扩增条带数量和清晰程度等最佳，同时结合试剂用量等因素，确定最优的反应体系：2 μl模板DNA(10 ng·μl-1)、2 μl引物(10 μmol·L-1)、9 μl Mix混合液和7 μl ddH2O。

2.4 反应体系稳定性的验证

应用优化后的燕麦SCoT-PCR反应体系，选取引物SCoT48对实验室的其他12个燕麦品种DNA进行扩增，不同燕麦品种扩增产物均清晰稳定(图3)，体现出了品种之间的差异，表明该体系能够进行稳定的PCR扩增，适合用于不同燕麦品种的SCoT-PCR分析及燕麦属饲用植物的研究。

3 讨 论

SCoT标记是一种基于翻译起始位点的目标分子标记新技术，具有操作简单、引物通用性高、多态性高、成本低且重复性好等优点[14]。其与较多的基因形成了较多的引物结合位点，且其扩增的不确定性介于外显子与内含子之间，大幅度提升了该引物的多态性[15]。与其它分子标记手段相比，SCoT标记技术与供试材料的功能基因相关，更能反应相关功能性状的多态性[16]，是适用于农作物、水果和牧草等植物种质资源鉴定、保护和利用、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、基因定位和克隆等研究的非常有效的一种分子标记[17]。本研究首次将SCoT分子标记技术应用于燕麦，通过本研究最终得到燕麦SCoT-PCR反应的最佳体系，且在其他燕麦品种中进行了验证，最终均能获得清晰稳定的扩增产物，为今后SCoT分子标记技术在燕麦上的应用奠定了理论基础。

准确应用SCoT分子标记技术的前提是首先要建立一个高效、稳定的SCoT-PCR反应体系。SCoT-PCR反应受多个因素的影响。退火温度是PCR扩增程序中的重要影响因素，本试验中各引物退火温度有较大区别主要集中在51.7～53.5 ℃，这与之前研究所用的退火温度不同。如韩国辉等[13]优化了柑橘SCoT分子标记适宜的退火温度，所有引物退火温度均为49 ℃；李强等[18]优化了大豆SCoT分子标记适宜的退火温度，引物最佳退火温度为50.4 ℃。导致该现象的原因可能是由于不同研究所用的试验材料及反应条件不一致，同时也验证了袁王俊等[19]的观点，表明不同的反应条件与材料导致退火温度不一致。因此，进行退火温度的优化可确保分子标记的准确性和扩增条带的特异性，达到理想的扩增效果。目前PCR主要采用是Mix反应混合液，其将PCR主要成分TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs预先进行混合，并加入稳定剂等成分使得PCR操作简便和稳定。本研究中采用2×TaqMaster Mix，在筛选多态性引物的同时进行各个引物退火温度的确定，共设置了8个梯度与4个重复，以此来确保各引物最佳退火温度的准确性，使复杂的试验流程简单化，易于操作。

4 结 论

在燕麦SCoT-PCR反应体系(20 μl)中，最优的组合为2 μl模板DNA(10 ng·μl-1)、2 μl引物(10 μmol·μl-1)、9 μl Mix混合液和7 μl ddH2O。