基于cpSSR标记的山药种质资源DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析

张静珍，王连军，雷 剑，柴沙沙，杨新笋，*，张文英

(1.长江大学 农学院，湖北 荆州 434025； 2.湖北省农业科学院 粮食作物研究所，湖北省甘薯工程技术研究中心，粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064)

山药(DioscoreaoppositeacThunb.)，是百合目(Liliales)薯蓣科(Dioscoreaceace)薯蓣属(Dioscorea)一年生或多年生缠绕性藤本植物，药食两用的经济作物[1]。中国亚热带地区是山药重要原产地及驯化中心，具有丰富的山药种质资源，由于山药产量高、适应性强，且耐贮藏、易运输、加工产品多样化，因此，在我国南北等地均有种植。栽培山药分为食用和药用两类，食用栽培山药分布于南方各省市，药用栽培山药的分布则以山西河南交界处为中心[2]。我国山药种质资源在长期种植过程中，由于生态环境的变化、人工选择、历史变迁，品种资源丰富，如铁棍山药、佛手山药、日本小叶山药、嘉祥细长毛山药、桂淮系列淮山等，这些品种从食用、药用形态和产量均有较大差异。另外我国野生山药资源种类也较为丰富，如栗川野山药、武穴野山药。我国山药种质资源多样性丰富，地区间引种，真假山药无法有效鉴定，分类鉴定难度大[3]。

随着分子生物学的不断发展，分子标记技术已广泛应用于山药的品种多样性分析，遗传图谱及DNA指纹图谱的构建。周延清等[4]用ISSR标记对28 个山药种质资源进行遗传多样性分析，7个ISSR引物共扩增出65个条带，多态性比率为83.01%；Mignouna等[5-6]利用AFLP标记构建了几内亚山药(DioscorearotundataPoir.)和水山药(DioscoreaalataL.)的遗传连锁图谱；华树妹等[7]对福建省34 份山药资源的遗传多样性进行RAPD分子标记分析遗传相似系数为0.66时， 可将34 份资源分成4 类，与园艺学分类相符；黄姗[8]选用了94 份山药材料，采用SRAP标记分析了供试种质的遗传多样性，并成功构建了86 份山药的DNA指纹图谱；刘向宇等[9]对35 份山药进行了ISSR分析，筛选出12个有效引物，多态性比率为97.18%；郭文等[10]研究了4种薯蓣属植物(盾叶薯蓣、小花盾叶薯蓣、山药、黄独)的遗传多样性，SSR分子标记多态性比率为98.55%；张文芳[11]利用怀山药的转录组数据结合20 份山药材料开发了5 个SSR标记，并对22 份山药进行遗传多样性分析，将其分为8类。

叶绿体微卫星(chloroplast SSR， cpSSR)，是一种新型高效的微卫星子标记技术结合了SSR和cpDNA的优点，和其他分子标记相比，具有重复性好，多态性高，显性遗传，分布广泛且进化缓慢，结构简单，分子量小，单亲保守遗传。因此，cpSSR标记已被广泛应用于作物遗传多样性研究[12]。李思巧等[13]在花椒中开发了cpSSR标记，可有效区分花椒、竹叶花椒和日本花椒，但在花椒种内并未检测出多态性；李博等[14]利用cpSSR分子标记对42份香蕉种质资源进行了遗传多样性分析，共检测出86条多态性条带，分类结果与地理分布相关；龚桂芝等[15]利用cpSSR结合SSR标记对枳属及其近缘属植物种质遗传多样性和亲缘关系进行了研究，结果显示，母系遗传为特征的枳属叶绿体基因组相对保守，核基因组SSR分析表明普通枳的遗传差异明显。

目前，cpSSR标记技术已被广泛应用到居群保护遗传学[12]、植物种群结构分析[16]和种群分类[17]等研究。然而，基于cpSSR标记技术分析山药遗传多样性分析和DNA指纹图谱构建的研究目前国内外未见报道。本研究采用cpSSR标记，对从国内外引进的64 份山药种质资源进行种质资源遗传多样性分析，并构建DNA指纹图谱。基于聚类结果，可为山药种质资源创新和育种亲本的选择及品种改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

64 份山药种质资源来源于河南省温县焦作农科所山药种质资源圃 (表1)。国内资源主要来源于湖北、河南、上海、广西、江苏等地，国外资源来源于日本。采取枝条上无病虫害的新鲜嫩叶，低温保存带回实验室，-80 ℃保存备用。

1.2 DNA提取及引物筛选

采集供试材料的幼嫩叶片，利用改良的CTAB法提取山药基因组DNA[18]。

1.3 cpSSR-PCR扩增

参考薯蓣(Dioscoreaopposita)叶绿体全基因组(GenBank登录号KY996494)[19]，共设计了21 对cpSSR引物，由天一辉远公司合成。筛选出10 对引物用于全部供试样品的PCR扩增(表2)。

表2 试验所用cpSSR引物序列信息

PCR扩增体系：dNTPs(10 mmol·L-1)2.0 μL，10×buffer(Mg2+) 2.5 μL，正向引物1.0 μL，反向引物1.0 μL，基因组DNA(50～60 ng·μL-1) 1.0 μL，Easy-TaqDNA Polymerase 0.5 μL，最后加水至25 μL；PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃ 保存。

PCR产物检测：0.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，105 V 电泳3 h，用0.1% AgNO3溶液进行染色，在1.5% NaOH溶液和甲醛溶液组成的显影液中显影，拍照，记录结果。

1.4 数据处理及分析

根据PCR产物的电泳结果，对cpSSR的扩增条带进行统计分析，采用人工读带的方法，在凝胶相同位置，扩增出DNA 条带记为“1”，同一位置无条带或条带模糊记为“0”，构建原始矩阵。使用NTSYS 2.10 软件进行不同样本间的遗传距离分析，SimQual程序求Jaccard相似系数，使用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析，Treeplot模块生成聚类[20]。根据表征矩阵，利用PopGen 32 软件计算Shannon信息指数I值和Nei’s基因多样性指数He值，并观察等位基因数(Na)，有效等位基因数(Ne)[21]。利用Excel 2016对0，1矩阵进行转制，构建与指纹编码相对应的山药种质资源的DNA指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 cpSSR标记扩增多态性及遗传多样性分析

选用遗传差异较大的日本青森、冀城2 号、佛手山药、铁棍山药四个山药种质资源，对21 对cpSSR引物进行筛选，最终筛选出10 对特异性引物。10 对引物在64 份种质资源中共扩增出69 条条带，其中多态性条带数为59，多态性比率为85.51%，每对引物扩增出清晰的条带数在2～14，平均为6.9 条，其中SY302扩增条带数最多，为14 条，引物SY69、SY196、SY216扩增条带数最少，均为3 条；平均多态性条带 5.9 条。多态位点百分率值为66.67%～100.00%(表3)。10对引物对64 份山药种质资源基因组DNA的扩增结果如图1所示。目前基于SSR标记，观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon 信息指数(I)和Nei’s基因多样性指数(He)[21]已广泛应用于评价作物遗传多样性水平。本研究中，64 份山药种质资源平均Na、Ne、He和I值分别为2、1.569 3、0.378 1和0.560 6(表3)；Ne变幅为1.231 1～1.916 0，He变幅为0.184 8～0.478 1，I变幅为0.329 0～0.671 1。试验结果表明，64 份山药种质资源遗传变异较为丰富，cpSSR可用于山药品种遗传多样性研究和DNA指纹图谱的构建。

M，Gene Ruler 100 bp plus Ⅱ DNA Ladder；1～64，64份山药资源。

表3 十对cpSSR引物扩增结果及多态性信息

2.2 六十四份山药种质资源遗传距离分析

采用(0，1)矩阵对扩增条带进行统计分析，64 份山药种质资源两两遗传距离在0.355 9～0.932 2，平均遗传距离为0.673 1，由此可知，64 份山药种质资源在cpSSR标记的水平上变异幅度较大，其中南京采山药和芹峰淮山药，遗传距离最近，为0.355 9，山西永济山药和苏蓣4 号遗传距离次之，为0.389 8，表明它们亲缘关系较近；山西太原山药和日本山药，襄汾城关刘存山药与日本青森山药，灌南山药和神农山4 号遗传距离最远，为0.932 2。

2.3 聚类分析

为了进一步确定64 份山药种质资源的遗传亲缘关系，利用NTSYS 2.10 软件，按照UPGMA方法建立了64 份山药种质资源的聚类图(图2)。由图 2可知，供试64 份种质资源以遗传相似系数0.63为阈值时，可以将供试种质分为4 类，第Ⅰ类群主要有紫玉淮山药、台湾紫山药、芹峰淮山药、安砂小叶薯，均来源于福建和中国台湾，属于闽南地区；第Ⅱ类群包括山西山药、嘉祥细长毛山药、白山药、自然薯蓣、日本白山药、南召山药，以秦岭淮河为分界线，将中国分为南北两地，秦岭淮河以北地区包括山东、山西、河北等地，南召山药则位于秦岭淮河分界线上，且该类山药来源于北方；第Ⅲ类包括明淮1 号、阳明山山药、明淮3 号、苏蓣4 号、苏蓣6 号，除了阳明山山药来源于中国台湾，其他均来自江苏；第Ⅳ类为其他49 份山药种质资源。根据聚类结果分析，来自相同或相近地域的优先聚类在一起，聚类结果与山药种质资源的来源有一定的关系，可能是长期互相引种的结果。

图2 六十四份山药种质资源的UPGMA聚类图

2.4 cpSSR指纹图谱

根据筛选的10对cpSSR引物的扩增结果，构建64份山药种质资源的DNA数字指纹图谱(表4)。由表4可知，任何一对引物都不能单独将所有供试种质资源完全区分。引物SY161区分能力最强，其次为SY302、SY326。SY161在64份山药种质资源中可区分35个基因型，但仍有29个种质资源无法区分。结合扩增条带型统计的难易程度及引物可重复性的高低等因素，将核心引物进行排序，首先用排在第一位的引物进行品种鉴定，如不能将所有供试种质资源区分，依序再加一个引物进行组合鉴别，依次类推，直至将所有种质区分开。本研究最少采用2对引物即可将所有供试种质资源完全区分，最终选用SY161、SY26构建64 份供试种质资源的指纹图谱。

表4 引物SY161及SY326构建64 份山药种质资源DNA指纹图谱

表4 二十份山药种质的遗传距离

3 讨论

山药在我国已有悠久的栽培历史，全国各地均有栽培并地区间相互引种，山药易受周围环境影响，部分种质资源外部形态特征相似、变异范围重叠，难以从形态上快速鉴定为相同种或者相同类群[9]。近年来，ISSR、RAPD、SRAP等[4，7，22]分子标记已应用于山药研究中，对山药遗传多样性鉴别起着重要作用，随着分子生物学鉴定技术的发展，cpSSR技术相对与ISSR、RAPD等标记相比，具有重复性好、操作简单等优点。本研究利用cpSSR分子生物学技术，以河南焦作温县山药种质资源圃的64份种质资源为研究对象，选用10对多态性好，电泳条带清晰，稳定性好的引物，对64份山药种质资源进行遗传多样性分析。结果显示，所有引物均为有效引物，共扩增出69条清晰条带，多态性条带59条，多态性比率为85.51%，cpSSR多态性比率较SSR相比略低[10]，其可能原因是核基因组比叶绿体基因组复杂。有效等位基因数变幅为1.231 1～1.916 0，平均值为1.569 3；Nei’s基因多样性指数变幅为0.184 8～0.478 1，均值0.378 1；Shannon多样性指数在0.329 0～0.671 1，均值0.560 6，表明我国不同地方山药种质资源遗传变异较为丰富，研究结果与刘向宇等[9]利用ISSR标记和黄玉仙等[20]利用SRAP标记分别对28份和94份山药种质资源的遗传多样性研究结果基本一致，用不同方法对山药种质资源的研究均表明了山药在分子水平上多态性丰富。但本研究选择的遗传群体较小，且存在“同物异名”等现象在进行遗传多样性分析时可能存在偏差。

通过(0，1)矩阵对扩增条带进行统计分析，64 份山药种质资源两两遗传距离为0.355 9～0.932 2，平均遗传距离为0.673 1。在实际生产过程中，铁棍山药(DioscoreaoppostiaThunb. cv. Tiegun)的药用价值高，产量较低，山药市场中普遍利用太谷山药(DioscoreaoppostiaThunb. cv. Taigu)来冒充铁棍山药，致使山药市场混乱，贾永芳等[23]利用HPLC法研究铁棍山药和太谷山药的成分组成及含量差异，超声提取法甄别2种山药的方法可为铁棍山药的品种鉴定提供依据。在本文研究中，太谷山药和铁棍山药遗传距离为0.813 6，距离较远，因此，通过cpSSR分子标记可有效鉴别铁棍山药和太谷山药，可为铁棍山药的品种鉴定和指纹图谱建立提供参考。UPGMA聚类结果显示，供试64份资源以遗传相似系数0.63为阈值时，可以将供试种质资源分为4 类，第Ⅰ类群来源于福建和中国台湾，属于闽南地区；第Ⅱ类群山药来源于北方地区；第Ⅲ类主要来源于江苏；第Ⅳ类为其他49 份山药种质资源。雷伏贵等[3]利用ISSR标记的聚类分析将94份山药资源分为4大类群，分别为薯蓣群、参薯群、山薯群、褐苞薯蓣群；华树妹等[7通过RAPD分子标记技术将34份山药种质资源分为普通山药、扁山药、田薯和福建大薯4类。与上述研究结果相比，本实验所分类群相对简单，这可能与本实验材料数量和引种地区局限性有关，从本研究的聚类结果来看，相同地区的品种优先被聚类在一起，说明与山药种质资源的原产地具有一定相关性，可能是长期互相引种的结果，这与覃维治等[24]在亲缘关系为分类特征对淮山药种质资源的分类结果一致。

利用分子标记构建DNA指纹图谱，遵循的原则：简单易操作、重复性好[25]。DNA指纹图谱技术是鉴定品种纯度和真实性的有效手段，特点是快速有效准确，已广泛应用于花生[26]、甘薯[27]、南瓜[28]等的遗传多样性研究。在科学研究中，品种鉴定的原则是选用较少的引物区分较多的品种，本研究中64份山药种质资源的指纹图谱中，多态性最好的引物SY161可同时鉴别35份山药种质资源，多态性最低的引物SY196可鉴别4份，且64份山药资源最少利用2对cpSSR多态性引物即可全部区分。DNA指纹图谱的差异性，揭示了供试山药种质资源的遗传多样性。另外，山药DNA 指纹图谱差异较小的种质资源大部分来源地相同，有少数不同，可能由于地区间长期互相引种、历史变迁及人工驯化等人为因素引起。

综上所述，cpSSR分子标记技术是一种鉴定山药种质的有效和实用的工具，它能检测到较好的多态性。cpSSR技术对于不同山药同名异物，名称混乱的山药品种的识别，生产中假冒伪劣品种的鉴定，种质创新中亲本选择和品种改良具有指导意义。