持续乙醇摄入通过抑制NRF2通路促进HMGB1及其下游炎性因子表达*

李昕曈,孙光涛，王 梦，戚询中，黄作义，黄昕艳，朱晓峰

(1.佳木斯大学附属第一医院神经内科，黑龙江佳木斯 154002；2.佳木斯大学附属第二医院神经内科，黑龙江佳木斯 154002；3.牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江牡丹江157000)

持续乙醇摄入会导致脑容量降低，皮层神经元丢失，其中以前额叶最明显[1]；同时还会导致多种神经病理病变，如认知功能损伤、痴呆等[2]。在这一过程中，炎性反应发挥重要作用；在分子水平，持续乙醇摄入能够增加脑皮质神经元促炎因子高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达，并通过HMGB1/TLR4(Toll-like receptor 4)途径，促进炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素(IL)-1β、IL-6的表达[2-3]； 但目前持续乙醇摄入活化HMGB1通路及其下游炎性反应的分子机制尚不清楚。

在持续乙醇摄入诱导的炎性反应中，抗氧化通路发挥重要作用，同时，调节抗氧化通路活性，能够缓解乙醇摄入所至的脑损伤[2]。课题组前期研究证实，核因子E2 相关因子2 (NRF2)广泛参与抗氧化应激反应及脑保护过程[4]；研究已证实，NRF2通路参与HMGB1通路及炎性因子的表达调控过程[5-7]；但目前，尚缺乏NRF2在乙醇摄入相关疾病中的研究。

在脑功能调节过程中，前额叶通过其丰富的皮层间及皮层下联络结构[8]，参与思维、情绪、行为等多种高级脑机能的调控过程。同时，前额叶与抑郁障碍、精神分裂等多种神经精神疾病密切相关。酗酒人群前额叶脑容量降低最为严重，是乙醇敏感至伤脑区之一[1]。因此，本课题在既往研究的基础上，构建持续乙醇摄入小鼠模型，观察持续乙醇摄入对模型小鼠前额叶炎性反应、HMGB1通路及NRF2通路的影响；并进一步干预模型小鼠NRF2的表达，分析NRF2通路在持续乙醇摄入小鼠前额叶HMGB1通路及炎性反应活化中的作用；为持续乙醇摄入导致脑损伤机制的阐述提供实验依据，并为NRF2通路相关药物在乙醇摄入相关疾病中的应用提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 实验试剂

TRIzol 购自美国Thermo Fisher Scientific公司，反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix与扩增试剂盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自日本TaKaRa公司；神经细胞培养所用Neurobasal、B27、双抗(P/S)、L-Glutamine均购自美国Gibco公司。NRF2通路特异激动剂特丁基对苯二酚(tBHQ)购自美国Selleck公司；HMGB1、NRF2、HO-1、β-actin抗体购自英国Abcam公司；蛋白裂解液RIPA、苯平基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制剂均购自碧云天公司，其余试剂购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1持续乙醇摄入动物模型制备

所用8周昆明雄性小鼠均来源于佳木斯大学实验动物中心；针对实验动物的所有操作均符合NIH:80-23标准，并经佳木斯大学伦理委员会批准。乙醇干预模型采用腹腔注射法建模：乙醇用无菌PBS稀释(20% v/v)，以2.0 g/kg对小鼠进行腹腔注射，每天1次，持续7 d；对照组以无菌PBS代替进行注射。

1.2.2模型干预及分组

为了明确NRF2通路在乙醇摄入活化HMGB1通路及炎性反应中的作用，本实验在证实持续乙醇摄入能够抑制模型小鼠前额叶NRF2通路基因表达的前提下，选用tBHQ干预模型小鼠，并检测其对模型小鼠前额叶HMGB1通路及炎性反应的影响；动物实验分为3组：对照组，乙醇干预组，tBHQ组(乙醇+tBHQ组)；tBHQ组在乙醇腹腔注射后，立即给予腹腔注射NRF2激动剂tBHQ，剂量为16.7 mg/kg[9]。并选择与乙醇摄入密切相关的炎性因子TNF-α、IL-1β及其上游HMGB1通路相关基因HMGB1、TLR2、TLR3、TLR4进行检测，观察小鼠前额叶炎性基因mRNA表达变化。

1.2.3原代神经元培养、鉴定及干预

为了进一步验证持续乙醇摄入通过抑制NRF2通路，进而激活HMGB1通路并促进其下游炎性反应这一结果，本实验在体内实验结果基础上，选用无血清培养法，应用新生1～4 d内昆明乳鼠皮层进行原代神经元培养，培养至第7天进行实验干预[10]；神经元完全培养液：Neurobasal、B27、双抗(P/S)、 L-Glutamine[11]。细胞实验分为3组：对照组(PBS组)，乙醇干预组，tBHQ组(乙醇+tBHQ组)；于培养第7天，除对照组外，各组均加入乙醇进行干预(75 mmol/L)[12]；tBHQ组加入tBHQ(40 ng/mL)；干预24 h后进行检测。

1.2.4实时荧光定量PCR检测

选用TRIzol 法提取前额叶及神经元总RNA，选用逆转录试剂盒逆转录样本mRNA；选用嵌合荧光法扩增试剂盒,以两步法扩增cDNA;检测结果用2-ΔΔCt法分进行统计分析。本实验所用引物均由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。样本mRNA逆转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃降温后取出保存。样本 cDNA扩增标准程序：预变性，95 ℃ 30 s；扩增，95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，循环40次；融解，95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，1个循环；降温，50 ℃ 30 s。引物序列见表1。

1.2.5Western blot检测

应用裂解液(RIPA+PMSF+蛋白酶抑制剂)及研磨介质破碎组织，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min后吸取上清液；应用BCA 法检测样本蛋白浓度；而后经电泳、转膜、封闭、一抗孵育(HMGB1 1∶8 000、HO-1 1∶1 500、NRF2 1∶500、β-a ctin 1∶5000)、洗膜、二抗孵育、洗膜、显影，并获取灰度值进行各蛋白表达水平的统计分析。

1.3 统计学处理

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 结 果

2.1 持续乙醇摄入对模型小鼠前额叶炎性反应及HMGB1通路的影响

与对照组相比，乙醇干预组小鼠前额叶炎性因子TNF-α(P=0.015)、IL-1β(P=0.017)mRNA相对表达水平升高(图1)；其上游HMGB1通路相关基因HMGB1(P=0.004)、TLR3(P=0.030)、TLR4(P=0.004)mRNA表达升高，但TLR2(P=0.071)表达无明显变化，见图1。

a：P<0.05，b:P<0.01。

2.2 持续乙醇摄入对模型小鼠前额叶NRF2通路的影响

为了分析持续乙醇摄入促进炎性反应的分子机制，本实验进一步分析了与炎性反应相关的NRF2通路基因在模型小鼠前额叶表达的变化，结果显示：与对照组相比，乙醇干预组小鼠前额叶NRF2(P=0.014、0.014)及其下游血红素氧合酶(HO-1)mRNA及蛋白相对表水平达均降低(P=0.030、0.012)，见图2。

2.3 激活NRF2通路对持续乙醇摄入模型小鼠前额叶炎性反应及HMGB1通路的影响

在对炎性反应基因表达检测中发现：与乙醇干预组小鼠比较，tBHQ组小鼠前额叶TNF-α mRNA(P=0.305)的表达并无影响；但tBHQ组IL-1β mRNA较乙醇干预组(P=0.003)的相对表达水平降低，同时，tBHQ组与对照组比较差异无统计学意义(P=0.540)。在对HMGB1通路的检测中发现，与乙醇干预组小鼠比较，tBHQ组小鼠前额叶TLR3 mRNA的表达并无影响(P=0.679)，但tBHQ组HMGB1(P=0.000)、TLR4(P=0.015)mRNA的相对表达水平及HMGB1(P=0.043)蛋白相对表达水平均降低；同时，tBHQ组以上HMGB1通路相关基因和蛋白与对照组比较差异均无统计学意义(P=0.642)，见图3。

A：NRF2与HO-1 mRNA表达变化；B：NRF2蛋白表达；C：HO-1蛋白表达；a:P<0.05。

A：炎性反应及HMGB1通路基因mRNA检测；B：HMGB1蛋白表达检测。a:P<0.05;b:P<0.01;c:P<0.001。

2.4 激活NRF2通路对乙醇干预后神经元HMGB1表达的影响

在体内实验结果基础上，构建了乙醇干预神经元细胞模型，应用MAP2标记神经元轴突，对原代培养神经元进行鉴定(图4C、D、E)；并检测NRF2通路激动剂对乙醇干预神经元HMGB1 mRNA及蛋白相对表达水平的影响；结果显示，与对照组相比，乙醇干预后神经元HMGB1 mRNA(P=0.000，图4A)及蛋白相对表达水平(P=0.006，图4B)明显升高；与乙醇干预组相比，tBHQ组神经元HMGB1 mRNA(P=0.001，图4A)及蛋白相对表达水平(P=0.004，图4B)明显下降，tBHQ组与对照组比较差异无统计学意义(图4A、B)。

A：HMGB1 mRNA检测；B：HMGB1蛋白表达检测；C：MAP2 神经突染色(×400)；D：DAPI 和MAP2 染色合并(荧光，×400)；E：DAPI和MAP2染色合并(常光、DAPI和MAP2染色合并，×400)。a:P<0.01;b:P<0.001。

3 讨 论

炎性反应在乙醇摄入相关疾病中发挥重要作用。既往研究显示，持续乙醇摄入能够促进模型小鼠脑小胶质细胞活化，增加炎性因子TNF-α、IL-1β,IL-6和MCP-1的表达[13]；在本实验中也发现，持续乙醇摄入能够增加模型小鼠前额叶炎性因子TNF-α、IL-1β mRNA相对表达水平，这一结果与既往研究结果相一致，进一步证实，持续乙醇摄入能够促进脑组织炎性反应发生。后续研究发现，酒精性脑损伤炎性因子的表达受HMGB1通路调控。HMGB1是一种主要由神经元分泌的内源性细胞因子；通过与炎性细胞TLRs受体结合，参与炎性基因表达的调控[14-15]；研究显示，HMGB1及其受体TLR2、TLR3和TLR4在酗酒人群及持续乙醇摄入大鼠模型内嗅皮层表达升高[16]；同时，乙醇诱导HMGB1表达升高能够促进炎性因子如IL-1β表达[3,16]；在本实验中也发现，持续乙醇摄入能够增加模型小鼠前额叶HMGB1及其受体TLR3和TLR4的表达，这一结果进一步说明，持续乙醇摄入能够促进HMGB1表达，进而调节炎性反应活性。

既往研究显示，持续乙醇摄入能够增加脑内氮氧化物 (NOX)表达，促进活性氧(ROS)的生成，进而促进氧化应激反应[2]；这一结果说明，氧化及抗氧化通路在酒精性脑损伤过程中发挥重要作用。NRF2通路是内源性抗氧化应答通路之一，通过与抗氧化元件ARE结合调节抗氧化酶分泌，发挥抗氧化应激作用[17]。进一步研究指出，促进NRF2表达能够抑制小鼠小胶质细胞炎性因子如IL-6，IL-1β及TNF-α的表达[5]；在脑出血模型中，激活NRF2通路能够抑制IL-1β的表达[6]；这一结果说明，NRF2通路参与炎性因子表达的调节过程。同时，在炎性疾病中，激活NRF2/HO-1通路能够抑制HMGB1的表达[7]；这一结果说明，NRF2通路能够通过抑制HMGB1通路调节炎性因子的表达。但目前，尚缺乏NRF2在乙醇摄入相关疾病中的研究。

在本实验中发现，持续乙醇摄入小鼠前额叶NRF2和HO-1 mRNA及蛋白相对表达水平均降低，提示持续乙醇摄入能够抑制小鼠前额叶NRF2通路活性，同时，这一结果与HMGB1通路及炎性因子在模型前额叶表达升高相吻合。这一结果说明，NRF2通路可能参与了持续乙醇摄入活化HMGB1通路及炎性反应的过程。为了进一步说明NRF2通路在这一过程中的作用，课题选用NRF2通路激动剂干预乙醇摄入动物及细胞模型，结果显示，NRF2通路激动剂能够完全逆转持续乙醇摄入引起的前额叶HMGB1 mRNA及蛋白相对表达水平升高以及神经元HMGB1 mRNA及蛋白相对表达水平升高，体内体外结果相一致。这一结果说明，NRF2通路激动剂能够抑制模型小鼠前额叶HMGB1的表达；同时也说明持续乙醇摄入能够通过抑制NRF2通路进而激活HMGB1通路。

在对HMGB1受体表达的分析发现，NRF2通路激动剂能够完全逆转持续乙醇摄入引起的前额叶TLR4转录水平升高，但对TLR3的表达并无显著影响；这一结果提示，激活NRF2通路能够抑制HMGB1/TLR4途径而非HMGB1/TLR3途径；同时，在对炎性因子表达分析也发现，NRF2通路激动剂能够完全逆转持续乙醇摄入引起的前额叶IL-1β转录水平升高，但TNF-α的表达并不受影响。既往研究显示，在乙醇摄入炎性反应过程中，TNF-α的表达与NLRP3/ASC炎性体表达密切相关[18]；结合本实验结果提示，在持续乙醇摄入模型中，TNF-α表达升高并非经由NRF2/HMGB1途径，而可能经由炎性旁支途径如调节NLRP3/ASC炎性体表达实现的。同时，以上结果也说明，持续乙醇摄入能够通过抑制NRF2通路进而激活HMGB1/TLR4通路，促进其下游IL-1β表达，进而促进炎性反应的发生。

本实验证实持续乙醇摄入能够通过NRF2通路调节HMGB1表达，但对于NRF2调节HMGB1表达的机制尚不清楚；既往研究证实，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)参与乙醇对神经元HMGB1表达的调控过程，但HDAC在NRF2通路调节HMGB1表达过程中的作用尚不明确，仍需进一步分析[3]。

综上所述，持续乙醇摄入能够抑制小鼠前额叶NRF2通路活性；并通过抑制NRF2通路进而激活HMGB1/TLR4通路，促进其下游IL-1β表达。相关研究可为乙醇摄入相关疾病机制的阐述提供理论基础。