鸦胆子废渣抑菌活性成分分析

何博 黄燕 陈琳 王灿灿 曾东强 唐文伟

摘要：【目的】探究鴉胆子去油后废渣的抑菌活性成分，为开发生物药肥提供理论依据。【方法】采用菌丝生长速率法、孢子萌发法和滤纸片法等测定鸦胆子废渣粗提物及不同溶剂萃取物对禾谷镰刀菌、茄子黄萎病菌和西瓜枯萎病菌等18种供试植物病原真菌的生物活性，并通过生物活性跟踪对其乙酸乙酯萃取物的化学成分进行分离及鉴定。【结果】在10 mg/mL浓度下鸦胆子甲醇提取物仅对水稻纹枯病菌具有抑制活性，其抑制率为33.33%;但在5 mg/mL浓度下其石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对供试病原真菌均具有一定的抑制作用，以乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最明显，对12种供试病原真菌菌丝生长均具有一定的抑制作用，其中对火龙果溃疡病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌的抑制率分别达75.71%、56.47%和51.72%，对应的致死中浓度（EC50）分别为2.65、3.48和2.10 mg/mL。乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌孢子萌发的抑制作用随浓度的升高而增强，在浓度为2.5000 mg/mL时抑制率达100.00%;在紫外光和自然光条件下乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌的抑菌活性稳定。从乙酸乙酯萃取物中分离得到catechol（1）、benzofuran-2-carboxaldehyde（2）、1H-Indazole（3）、vanillic acid（4）、cleomiscosin A（5）等5种化合物，其中，化合物2和3为首次从鸦胆子中分离获得，但化合物1、2、4和5对供试火龙果溃疡病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌均无显著抑菌活性（P>0.05）。【结论】鸦胆子废渣中含有抑菌活性成分，在植物病害防控上具有良好的应用前景。

关键词： 鸦胆子废渣;抑菌活性;化学成分

中图分类号： S432                               文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-1002-10

Antifungal active chemical constituents of

Brucea javanica residue

HE Bo， HUANG Yan， CHEN Lin， WANG Can-can， ZENG Dong-qiang，

TANG Wen-wei*

（College of Agriculture， Guangxi University/Guangxi Key Laboratory of Agric-environment and

Agric-product Safety， Nanning  530004， China）

Abstract：【Objective】This study attempted to find antifungal active components of Brucea javanica residue （oil was removed），which could provide reference for development and utilization of biological medicine and fertilizer. 【Method】Mycelium growth rate method， spore germination method and filter paper method were used to determine the biological activities of the extracts of B. javanica residue against 18 tested pathogenic fungi， such as Fusarium graminearum Schw， Verticillium dahliae Kleb and F. oxysporum f. sp. niveum（E. F. Smith） Synder & Hansen， etc. And through biological activity tracking， the chemical composition of its ethyl acetate extract was separated and identified. 【Result】The results indicated that the methanol extracts of B. javanica only had antifungal activity against Thanatephorus cucumeris（Frank） Domk with the inhibition rate of 33.33% at the concentration of 10 mg/mL. However， the extracts of petroleum ether and ethyl acetate had obvious inhibitory effect on the tested pathogenic fungi activity at the concentration of 5 mg/mL， especially the extracts of ethyl acetate， which had antifungal activity against 12 tested pathogenic fungi including Neoscytali-dium dimidiatum（Penz.） Crous & Slippers， F. oxysporum f. sp. momordicae Sun & Huang J Wand T. cucumeris with inhibition rates of 75.71%， 56.47%， 51.72% andmedial lethal concentration（EC50） values were 2.65， 3.48， 2.10 mg/mL， respectively. The inhibitory effect of ethyl acetate extract on the spore germination of N. dimidiatum could be enhanced with the increase of concent ration. At the concentration of 2.5000 mg/mL， the inhibition rate could reach 100.00%. The antifungal activity against N.dimidiatum of ethyl acetate extract remained stable under the conditions of ultraviolet light and natural light. Five chemical components， catechol（1）， benzofuran-2-carboxaldehyde（2）， 1H-Indazole（3）， vanillic acid （4）， cleomiscosin A（5）， were isolated from the ethyl acetate extracts， and the benzofuran-2-carboxaldehyde（2） and 1H-Indazole（3） were isolated from B. javanica for the first time. Catechol（1）， benzofuran-2-carboxaldehyde（2）， vanillic acid（4）， and cleomiscosin A （5） had no significant antifungal activity against N. dimidiatum， F. oxysporum f. sp. momordicae and T. cucumeris（P>0.05）. 【Conclusion】B. javanica residue contains antifungal activity components， providing a good application prospect for controlling plant diseases.

Key words： Brucea javanica residue; antifungal activity; chemical constituents

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660529）; Guangxi Innovation Driven Development Special Project（Guike AA18118015）

0 引言

【研究意义】近年来，我国植物提取物行业发展迅猛，其涉及到食品、化工、中成药及植物源农药等诸多领域（李若鹏，2018）。但从植物材料中提取获得的目标有效成分含量较少，生产过程中通常需要耗费大量的植物原料，同时产生大量提取残渣。目前对于提取残渣主要采用焚烧、堆放及填埋等手段进行处理，不仅造成资源浪费，还会污染环境，因此，研发出妥善的植物提取残渣处理和利用方式十分必要（周达彪和唐懋华，2007）。植物材料在提取目标有效成分后，其残渣中仍含有许多活性成分及有机质，若将其制成生物药肥，一方面可将植物提取残渣资源化利用，另一方面施用生物药肥不仅可有效控制目前农业生产中难以解决的土传和种传病害，还兼具改良土壤、增产增收及改善农产品品质等多重效果（吴传万等，2014;张兴等，2015）。目前针对鸦胆子[Brucea javanica （L.） Merr.]的商业利用主要是制备鸦胆子油，进一步将其制成乳剂或软胶囊用于多种癌症的辅助性治疗，而在鸦胆子油制备过程中产生的大量药渣主要作为畜禽饲料添加剂使用（王群，2016）。鸦胆子废渣中尚存在大量活性较高的化学成分及大量有机质（罗应等，2019），具有较高的研究价值，因此探究鸦胆子去油后废渣的生物活性成分具有重要意义。【前人研究进展】至今，有关植物提取残渣加工成具有营养、杀虫、防病及改善土质等多重效果的生物药肥已有较多研究。施用党参、地黄和百部等中药残渣经无害化技术处理后与肥料（微肥、有机肥）合理组配而成的生物有机药肥，不仅能有效防治花生和马铃薯等农作物病害，还能改善农作物品质，增产增收，且不同程度地改善土壤理化性质（毕军等，2008;史桂芳等，2010）。砂地柏残渣与纤维素分解菌发酵腐熟后施用，可显著提高对番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌及棉花黄萎病等6种植物病害的防治效果（袁旭超，2008）。马齿苋残渣与砂地柏残渣经堆肥化处理为浸提液，施用该浸提液可显著提高对黄瓜灰霉病、霜霉病和炭疽病的防治效果（李春霄等，2009）。苦豆子渣辅以楝树和牛心朴子等植物干粉混配研发出具有显著防病效果，且兼具营养、改良土壤等多种功能于一体的新一代生态环保型药肥，对黄瓜施用后不仅有促生长作用，还能改善土壤理化性质和黄瓜品质等（吴传万等，2014）。苦参提取残渣与生防链霉菌发酵腐熟施用不仅明显提高对辣椒立枯病和草莓根腐病的防治效果，还具有促进辣椒和草莓生长的作用（王海滨，2015）。海带渣与生防芽孢杆菌Hitwh-BA2经堆肥化处理制成的海带渣生物药肥能有效减少土壤中寄生曲霉的数量，还显著增加土壤中细菌的数量（肖伟和闫培生，2015）。印楝渣与解淀粉芽孢杆菌HN-11经堆肥化处理为腐熟的生物药肥，施用该生物药肥不仅能有效防控香蕉枯萎病的发生，还具有促进香蕉生长的作用（赖多等，2017）。目前对鸦胆子废渣進行综合利用已有少量研究报道。鸦胆子废渣不同溶剂提取物对苹果褐腐病菌、薯蓣炭疽病菌和意大利青霉等多种植物病原菌具有防治效果（李海燕等，2009;白丽莎等，2015;陈楚英等，2016）;鸦胆子废渣经堆肥化处理为腐熟的生物有机药肥，施用该生物药肥不仅能有效控制土传病害，还具有改良土壤及提高作物产量等功效（徐汉虹等，2017）。【本研究切入点】目前，有关鸦胆子废渣抑菌活性成分的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用菌丝生长速率法、孢子萌发法和滤纸片法测定鸦胆子废渣不同提取物及化合物对植物病原菌的生物活性，明确鸦胆子废渣的抑菌活性成分，为开发生物药肥提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试植物 鸦胆子的干燥成熟种子2018年9月采集于广西百色市田林县，恒温鼓风干燥箱中50 ℃烘干，去油，粉碎机粉碎，40目过筛称重，放入密封袋中遮光保存备用。

1. 1. 2 供试植物病原真菌 供试植物病原真菌共18种，分别为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schw）、茄子黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）、西瓜枯萎病菌[Fusarium oxysporum f. sp. niveum （E. F. Smith） Synder & Hansen]、马铃薯立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）、香蕉炭疽病菌[Collectorichum musae（Berk. & Curt.） Arx]、水稻稻瘟病菌[Pyricularia grisea（Cooke） Sacc]、香蕉枯萎病菌4号小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4）、甘蔗梢腐病菌（Fusarium moniliforme Sheldon）、番茄立枯病菌（Rhizoctonia colani Kühn.）、苦瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae Sun & Huang J W）、姜白绢病菌（Sclerotium rolfsii Sacc）、香蕉煤纹病菌[Helminthosporium torulosum （Sydow） Ashby]、柑橘拟茎点霉（Phomopsis citri Fawcett）、胶孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides（Penz） Sacc]、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers. ex Fr）、辣椒炭疽病菌（Gloeosporium piperatum Ell. et EV）、火龙果溃疡病菌[Neoscytalidium dimidiatum （Penz.） Crous & Slippers]和水稻纹枯病菌[Thanatephorus cucumeris（Frank） Donk]，均由广西大学农学院植物病理研究室提供。

1. 1. 3 试剂与仪器 主要试剂：甲醇、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇均为市售分析纯;37%苯醚甲环唑水分散粒剂（寿光晨阳农化有限公司）;马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）（广东环凯微生物科技有限公司）;柱层析硅胶（100～200目和200～300目）（青岛海洋化工厂分厂）;Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（Amersham生物科学公司）。主要仪器设备：DHG型系列电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）;LX-05 250克多功能粉碎机（上海江信科技有限公司）;BI型系列电子天平（厦门百伦斯电子科技有限公司）;N-1100旋转蒸发仪（上海泉杰仪器有限公司）;FD50A高压灭菌锅[至微（厦门）仪器有限公司];PRX-600C智能培养箱系列（宁波赛福实验仪器有限公司）;CX21显微镜（OLYMPUS）;Bruker AVANCE Ⅲ HD-600核磁共振仪（Zurich，Swiss）。

1. 2 植物材料提取

1. 2. 1 植物粗提物制备 将鸦胆子种子（去油后）干粉10 kg分置入锥形瓶（3 L）中（每次装入500 g干粉），加入一定量甲醇（v/v=1∶3），超声提取1 h（期间每隔15 min搅拌1次）（王新源，2018），重复提取3次，合并滤液，用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，得甲醇粗提物浸膏（1230 g），置于4 ℃冰箱中保存备用。

1. 2. 2 植物萃取物制备 将鸦胆子甲醇粗提物（1230 g）用蒸馏水（水温低于50 ℃）充分热溶，倒入分液漏斗悬浮，分别用等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，合并萃取液，减压蒸馏浓缩，得石油醚萃取物（714 g）、乙酸乙酯萃取物（52 g）和正丁醇萃取物（177 g），置于4 ℃冰箱中保存备用。

1. 3 抑菌活性生物测定

1. 3. 1 对病原菌菌丝生长抑制作用测定 采用菌丝生长速率法（沈晋良，2013）进行测定：鸦胆子甲醇粗提物及石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物分别以甲醇或丙酮配制成一定浓度药液，准确吸取1.0 mL药液加入到9.0 mL PDA培养基（冷却至45 ℃左右）中，混匀后倒入直径为9 cm的培养皿，制成所需浓度的含鸦胆子粗提物或萃取物培养基，以加入相同体积溶剂的培养基为对照。将打孔器打制的6 mm不同植物病原菌菌饼分别接种于培养基中央（带有菌丝的一面朝下），置于（25±1）℃的恒温培养箱中培养一定时间后，采用十字交叉法测量菌落直径，每处理3次重复，按公式计算抑制率。

抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直

径）/（对照组菌落直径-6）×100  （1）

1. 3. 2 对病原菌毒力测定 采用菌丝生长速率法（沈晋良，2013）进行测定。鸦胆子乙酸乙酯萃取物和苯醚甲环唑分别以甲醇配制成一定浓度母液，准确吸取1.0 mL药液加入到9.0 mL PDA培养基（冷却至45 ℃左右）中，混匀后倒入直径为9 cm的培养皿，制成所需浓度的含鸦胆子乙酸乙酯萃取物或苯醚甲环唑培养基。将母液对半稀释，以相同方法依次配制成5.0000、2.5000、1.2500、0.6250和0.3125 mg/mL等5个浓度梯度的含鸦胆子乙酸乙酯萃取物培养基，对照药剂配制成1.6、0.8、0.4、0.2和0.1 μg/mL等5个浓度梯度的含苯醚甲环唑培养基。其余操作方法同1.3.1。以待测药液浓度的对数值（x）和菌絲生长抑制率的几率值（y）绘制毒力曲线，计算毒力回归方程、致死中浓度（EC50）及其95%置信限。

1. 3. 3 对病原菌分生孢子萌发抑制作用测定 采用孢子萌发法（方中达，2007;李晶等，2018）进行测定。向生成大量孢子的菌种培养皿中加入一定量无菌水，用涂布棒轻轻刮下分生孢子和菌丝，3层纱布过滤，制成测试所需浓度的病原菌孢子悬浮液。鸦胆子乙酸乙酯萃取物以甲醇配制成一定浓度母液，准确吸取1.0 mL不同浓度药液或甲醇（CK）分别与1.0 mL病原菌孢子悬浮液混匀，用移液枪吸取20 μL混合液至凹玻片上，以相同方法依次配制成5.0000、2.5000、1.2500、0.6250和0.3125 mg/mL系列浓度，每处理3次重复，置于温度（25±1）℃、相对湿度（75±1）%的恒温培养箱中恒温保湿培养，待对照组孢子萌发率达80%以上时，观察记录孢子总数和孢子萌发数。按公式计算孢子萌发率和抑制率。

孢子萌发率（%）=（孢子萌发数/观察孢子总数）×

100  （2）

孢子萌发抑制率（%）=（空白孢子萌发率-处理

孢子萌发率）/空白孢子

萌发率×100 （3）

1. 3. 4 萃取物抑菌活性及稳定性测定

1. 3. 4. 1 抑菌活性测定 采用滤纸片法（戚馨月等，2020）进行测定。鸦胆子乙酸乙酯萃取物以甲醇配制成一定浓度药液;将无菌的6 mm滤纸片分别于药液或甲醇（CK）中充分浸泡，取出沥干;取0.1 mL病原菌孢子悬浮液至培养基，用无菌涂布棒涂布均匀，将上述滤纸片3片为一组呈正三角形平铺于培养皿中，每处理3次重复，置于（25±1）℃的恒温培养箱中培养24 h后，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1. 3. 4. 2 稳定性测定 采用滤纸片法（戚馨月等，2020）测定在不同pH、温度、金属离子及紫外光、自然光、氧化条件下鸦胆子乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌抑菌活性的稳定性。酸碱稳定性测定：用1 mol/L HCL或NaOH将萃取物的pH分别调至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0，以未经酸碱处理的萃取物为对照。热稳定性测定：将萃取物分别在40、60、80、100和121 ℃的条件下处理30 min，待自然冷却，以未经加热处理的萃取物为对照。紫外光稳定性测定：将萃取物在距离紫外灯30 cm处分别照射20、30、40、50和60 min，以未经紫外线处理的萃取物为对照。自然光稳定性测定：将萃取物在恒温培养箱中分别灯光照射2、4、6、8、10和12 h，以未经自然光处理的萃取物液为对照。氧化稳定性测定：将萃取物在室温下于空气中分别暴露6、12、24、48和96 h，然后用含20% Tween-80溶液配制药液，以未经氧化处理的萃取物为对照。金属离子稳定性测定：将萃取物分别与含0.5 g/mL Ag+、Na+、K+、Ca2 +、Mn2+ 和 Zn2+ 的盐溶液（含0.5% Tween-80）等体积混合，以未经金属离子处理的萃取物为对照。

1. 4 萃取物化学成分分离及鉴定

综合运用中压制备、硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析和硅胶薄层层析等分离手段，对鸦胆子乙酸乙酯萃取物的抑菌活性成分进行跟踪分离，以核磁共振谱（NMR）和质谱（MS）数据，并查找文献，鉴定分离得到的化合物结构。

将鸦胆子乙酸乙酯萃取物（52 g）以200.0 g 100～200目硅胶拌样，经硅胶柱层析（200～300目，柱子为12.0 cm×120.0 cm），分别以石油醚∶乙酸乙酯（100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50）和乙酸乙酯∶甲醇（100∶0、90∶10、80∶20、60∶40、0∶100）为流动相梯度洗脱，减压蒸馏所得洗脱液，经TLC板薄层层析分析，合并得到O、A、B、C、D、E和F等7个流分。

将流分段B（2.6 g）经Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱层析后，经TLC板薄层层析分析，得到2个流分段，记为B1～B2。将流分段B2经Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱层析后，经TLC板薄层层析分析，得3个流分段，记为B2.1～B2.3。将B2.3经Sephadex LH-20（甲醇）柱层析后，经TLC板薄层层析分析，得3个流分段，记为B2.3.1～B2.3.3。将B2.3.2以0.6 g 100～200目硅胶拌样，经硅胶柱层析（100～200目，2.5 cm×58.0 cm），以石油醚∶丙酮（90∶10、80∶20、75∶25、70∶30）为流动相梯度洗脱，经TLC板薄层层析分析，得2个流分段，记为B2.3.2.1～B2.3.2.2，B2.3.2.1经反复Sephadex LH-20（甲醇）柱层析后，经TLC板薄层层析分析，得到化合物1。将流分段B2.3.3以1.0 g 100～200目硅胶拌样，经硅胶柱层析（100～200目，2.5 cm×58.0 cm），以石油醚∶丙酮（100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30）为流动相梯度洗脱，经TLC板薄层层析分析，得2个流分段，记为B2.3.3.1～B2.3.3.2，将B2.3.3.1经反复Sephadex LH-20（丙酮）柱层析后，经TLC板薄层层析分析，得到化合物2。

将流分段C（6.2 g）以5.0 g 100～200目硅胶拌样，经快速中压制备系统制备，分别以石油醚∶乙酸乙酯（100∶0～0∶100）和乙酸乙酯∶甲醇（100∶0～ 0∶100）为流动相梯度洗脱，经TLC板薄层层析分析，得到6个流分段，记为C1～C6。

将流分段C2以5.0 g 100～200 目硅胶拌样，经快速中压制备系统制备，分别以石油醚∶乙酸乙酯（100∶0～0∶100）和乙酸乙酯∶甲醇（100∶0～0∶100）为流动相梯度洗脱，经TLC板薄层层析分析，得到4个流分段，记为C2.1～C2.4。将流分段C2.2经Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱层析后，经TLC板薄层层析分析，得到6个流分段，记为C2.2.1～C2.2.6。将C2.2.6以0.8 g 100～200目硅胶拌样，经硅胶柱层析（200～300目，1.1 cm×34.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、97∶3、95∶5、90∶10）为流动相梯度洗脱，经TLC板薄层层析分析，得到3个流分段，记为C2.2.6.1～C2.2.6.3。将C2.2.6.2经Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱层析后，再以0.5 g 100～200目硅胶拌样，经硅胶柱层析（200～300目，1.1 cm×41.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、97∶3、95∶5、90∶10）为流动相梯度洗脱，经TLC板薄层层析分析，得到化合物3。

将流分段C4以2.1 g 100～200目硅胶拌样，经硅胶柱层析（200～300目，3.0 cm×58.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、99∶1、97∶3、95∶5、92∶8）为流动相梯度洗脱，经TLC板薄层层析分析，得到2个流分，记为C4.1～C4.2。将C4.2以0.8 g 100～200目硅胶拌样，经硅胶柱层析（200～300目，1.1 cm×34.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、95∶5、90∶10）为流动相梯度洗脱，经TLC板薄层层析分析，得到化合物4。

将流分段C5经Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱层析后，经TLC板薄层层析分析，得到3个流分段，记为C5.1～C5.3。将C5.1经Sephadex LH-20（氯仿—甲醇）柱層析后，经TLC板薄层层析分析，得到2个流分段，记为C5.1.1～C5.1.2。将C5.1.2以1.0 g 100～200目硅胶拌样，经硅胶柱层析（100～200目，2.5 cm×58.0 cm），以氯仿∶甲醇（100∶0、98∶2、95∶5、90∶10）为流动相梯度洗脱，经TLC板薄层层析分析，得到化合物5。

1. 5 化合物抑菌活性测定

采用滤纸片法（刘学勇和姬志勤，2019）进行测定。化合物用甲醇配制成一定浓度药液，其余操作方法同1.3.4.1。

1. 6 统计分析

采用Excel 2003、SPSS 23.0和DPS 9.50进行试验数据统计分析，采用单因素分析和Duncans新复极差法进行方差分析，采用MestreNova进行NMR谱图分析处理。

2 结果与分析

2. 1 鸦胆子提取物抑菌活性测定结果

以禾谷镰刀菌、茄子黄萎病菌和西瓜枯萎病菌等18种植物病原真菌为供试病原菌，采用菌丝生长速率法对鸦胆子甲醇粗提物（10 mg/mL）及石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物（均为5 mg/mL）的抑菌活性进行测定。结果（表1）显示，10 mg/mL鸦胆子甲醇粗提物仅对水稻纹枯病菌具有抑制活性，抑制率为33.33%。在5 mg/mL浓度下，3种萃取物对供试病原真菌的抑制活性存在差异，其中，乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最强，对12种供试病原真菌菌丝生长均具有一定的抑制作用;石油醚萃取物次之，对3种供试病原真菌具有抑制作用;而正丁醇萃取物对供试病原真菌均无抑制作用。乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌菌丝生长均具有显著的抑制作用（P<0.05，下同），其中对火龙果溃疡病菌的抑制率最高，为75.71%，对苦瓜枯萎病菌的抑制率次之，为56.47%，对二者的抑制率均显著高于其他植物病原菌。综合表1结果分析，鸦胆子废渣的抑菌活性成分主要集中于乙酸乙酯萃取物中。

2. 2 乙酸乙酯萃取物对3种供试病原真菌的毒力

进一步测定鸦胆子乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌3种病原真菌的毒力。结果（表2）表明，鸦胆子乙酸乙酯萃取物对3种病原真菌菌丝生长均具有明显的抑制作用，其中对水稻纹枯病菌的抑制作用最强，其EC50为2.10 mg/mL;对苦瓜枯萎病菌的抑制作用最弱，其EC50为3.48 mg/mL。

为明确鸦胆子乙酸乙酯萃取物的抑菌活性，对3种供试病原真菌进行显微观察，其中火龙果溃疡病菌产生分生孢子，故后续进一步测定乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌孢子萌发的抑制作用。

2. 3 乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌孢子萌发的抑制作用

采用孢子萌发法测定鸦胆子乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌孢子萌发的抑制作用。结果（图1和表3）表明，随着处理浓度的不断升高，鸦胆子乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌孢子萌发的抑制作用不断增强，在浓度为2.5000 mg/mL时其抑制率已达100.00%，EC50为0.78 mg/mL。

2. 4 乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌抑菌活性的稳定性

由图2可知，在不同pH、温度、金属离子及氧化条件下鸦胆子乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌的抑菌活性不稳定;而在紫外光和自然光条件下乙酸乙酯萃取物对火龙果溃疡病菌的抑菌活性稳定。

2. 5 乙酸乙酯萃取物化学成分分离及鉴定结果

综合运用中压制备、硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析和硅胶薄层层析等分离方法对鸦胆子乙酸乙酯萃取物的化学成分进行分离，结果得到5种化合物。化合物结构见图3。

化合物1：无色针状结晶（甲醇），易溶于甲醇，能溶于丙酮，不溶于氯仿。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.89（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，4），6.82（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，5）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 161.9（C-1，6），131.6（C-3，4），114.6（C-2，5）。上述数据与文献（詹艳芝，2019）报道基本一致，故鉴定为catechol。

化合物2：无色粉末（甲醇），易溶于甲醇，微溶于丙酮，不溶于氯仿。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 8.10（1H，s，H-3），8.18（1H，dt，J=7.8，1.2 Hz，H-4），7.26（1H，ddd，J=15.0，8.0，1.0 Hz，H-5），7.30（1H，ddd，J=15.0，8.0，1.0 Hz，H-6），7.49（1H，dd，J=8.0，1.2 Hz，H-7），9.89（1H，s，H-1'）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 137.5（C-2），138.2（C-3），118.7（C-3a），120.9（C-4），122.2（C-5），123.6（C-6），111.7（C-7），124.3（C-7a），186.0 （C-1'）。上述数据与文献（Maulidiani et al.，2009）报道基本一致，故鉴定为benzofuran-2-carboxaldehyde，为首次从鸦胆子中分离获得。

化合物3：无色片状结晶（甲醇），能溶于甲醇，不溶于丙酮和氯仿。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.45（1H，d，J=7.2 Hz，H-8），7.21（1H，m，H-7），7.18（1H，m，H-6），8.09（1H，d，J=7.2 Hz，H-5），7.96（1H，s，H-3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 131.9（C-3），122.1（C-4），120.9（C-5），120.6（C-6），126.1（C-7），111.4（C-8），136.8（C-9）。上述数据与文献（任英杰等，2020）报道基本一致，故鉴定为1H-Indazole，为首次从鸦胆子中分离获得。

化合物4：无色羽状结晶（甲醇），易溶于甲醇，能溶于丙酮，不溶于氯仿。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.56（2H，dd，J=6.6，1.8 Hz，H-1 and H-2），6.84（1H，d，J=6.6，8.4 Hz，H-5），3.94（3H，s，4-OCH3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 112.4（C-1），114.4（C-2），114.4（C-5），123.8（C-6），147.2（C-4），151.1（C-3），168.9（C-7），54.9（-OCH3）。上述數据与文献（Renata et al.，2010;赵廷，2015）报道基本一致，故鉴定为vanillic acid。

化合物5：无色粉末（DMSO），易溶于DMSO，不溶于甲醇、丙酮和氯仿。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）：δ 6.35（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），7.96（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），6.92（1H，s，H-5），7.03（1H，d，J=1.8 Hz，H-2'），6.83（1H，d，J=7.8 Hz，H-5'），6.88（1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6'），4.98（1H，d，J=1.8 Hz，H-7'），4.33（1H，m，H-8'），3.39，3.66（each 1H，m，H-9'），3.78（3H，s，6-OCH3），3.79（3H，s，3'-OCH3）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）：δ 160.5（C-2），113.7（C-3），145.7（C-4），101.2（C-5），145.3（C-6），138.5（C-7），132.1（C-8），137.5（C-9），111.7（C-10），115.8（C-1'），112.5（C-2'），148.1（C-3'），147.7（C-4'），127.1（C-5'），121.2（C-6'），76.7（C-7'），78.3（C-8'），60.3（C-9'），56.2（6-OCH3），56.3（3'-OCH3）。上述数据与文献（Ray et al.，1985;Kumar et al.，1988;赵丽娟，2014）报道基本一致，故鉴定为cleomiscosin A。

2. 6 化合物抑菌活性测定结果

以火龙果溃疡病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌为供试病原菌，采用滤纸片法对化合物1、2、4和5的抑菌活性进行测定，结果表明，在200 μg/mL浓度下，化合物1、2、4和5对3种供试病原真菌均无显著抑菌活性（P>0.05）。

3 讨论

本研究从鸦胆子废渣乙酸乙酯萃取物中分离得到5种化合物，其中，化合物1H-Indazole（3）、vanillic acid（4）与罗应等（2019）从鸦胆子废渣中分离获得3-吲哚甲醛和3，4-二羟基苯甲酸化合物相似，其结果说明鸦胆子废渣中尚存在大量吲唑类和苯丙素类化合物。另外，化合物catechol（1）、benzofuran-2-carboxaldehyde（2）、vanillic acid（4）、cleomiscosin A（5）对供试火龙果溃疡病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌等3种病原真菌均无显著抑菌活性。但有研究表明，化合物catechol和vanillic acid对植物病原真菌具有一定抑制作用，分离自怀槐心材提取物中的化合物catechol在药液浓度为2%时，对褐腐菌、球毛壳菌、宛氏拟青霉菌和白腐菌菌丝生长有较好的抑制作用（苏文强，2008）;从链霉菌4301菌株的代谢产物中分离得到的化合物vanillic acid在浓度为10 mmol/L时对荔枝霜疫霉菌有很好的抑制作用，其抑菌圈直径达28 mm（陈敏等，2009）。因此，本研究分离获得的化合物1、2、4和5虽然对3种供试病原真菌均无显著抑菌活性，但在植物病害的防控上仍具有一定的利用价值，鸦胆子废渣中抑菌活性成分还有待进一步分离。

目前，鸦胆子在商业上的利用主要是将鸦胆子油制成乳剂或软胶囊，而在鸦胆子油生产过程中会产生大量的鸦胆子废渣，主要处理方式是将其作为畜禽饲料添加剂，不仅未能充分发挥废渣的药用价值，还会造成废渣资源的大量浪費（王群，2016）。据文献报道，鸦胆子废渣仍具有一定的抑菌活性，鸦胆子丙酮提取物在浓度为8 mg/mL时对薯蓣炭疽菌菌丝生长有很好的抑制作用，其抑制率在80%以上（白丽莎等，2015）;鸦胆子乙醇提取物在浓度为0.1 mg/mL时对苹果褐腐病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌和草莓软腐病菌菌丝生长均有一定的抑制作用（李海燕等，2009）;对意大利青霉也具有良好的抑制作用，其最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）分别为6.25和12.50 mg/mL（陈楚英等，2016）。鸦胆子废渣作为生产废弃物资源较丰富，且废渣中仍含有具有抑菌作用的活性成分及大量有机质，将其制成生物药肥，使之合理使用，可变废为宝，避免资源浪费。

本研究采用菌丝生长速率法和滤纸片法测定鸦胆子废渣不同提取物及单体化合物对植物病原真菌的抑菌活性，其中，菌丝生长速率法对样品所需量较多，抑菌活性测定结果偏高;滤纸片法对样品所需量较少，其测定结果易受药剂溶解后扩散能力的影响;但两者均具有操作简单、重现性好的优点。综合使用2种方法不仅可相互验证测定结果，还可避免漏选有杀菌效果的植物活性成分。

4 结论

鸦胆子废渣乙酸乙酯萃取物对多种植物病原菌具有抑菌活性，尤其对火龙果溃疡病菌、苦瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌抑菌活性较强，且在紫外光和自然光条件下对火龙果溃疡病菌的抑菌活性稳定。可见，鸦胆子废渣在植物病害防控上具有良好的应用前景。

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（責任编辑 麻小燕）