超高效液相色谱-串联质谱法测定茶饮料中15种吡咯里西啶生物碱

韩浩蕾 姜长岭 王 晨 王子琪 张相春 刘 新 鲁成银 陈红平

（1.中国农业科学院茶叶研究所，杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.农业农村部茶叶产品质量安全风险评估实验室，杭州 310008；4.安徽农业大学，合肥 230036)

吡咯里西啶生物碱（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物次级代谢产物，主要分布于远缘相关的被子植物科，涉及菊科、紫草科和豆科等13个科，通常集中在植物的种子和开花部位，其叶、茎和根中的含量较低[1～2]。目前已经在6 000多种植物（可能占所有开花植物的3%～5%）中鉴定出660多种PAs及其N－氧化物形式（PANOs）[3～4]。PAs也是一类植物毒素，其具有肺毒性、致癌性、遗传毒性及致畸胎作用等多种毒性。据报道，已有超过15 000例急性人类PAs中毒病例[5～7]。因此，研究食品中的PAs类物质的污染水平及来源、合理监测以及风险评估对于保障食品安全具有极其重要的作用。

PAs不属于茶叶内源污染物，但PAs污染茶叶已成为全球性质量安全问题[8]。欧美国家已重点监测了花草茶中PAs污染水平，发现与其他食品和农产品相比，茶叶PAs污染范围广、污染程度较高且其浓度变化范围大。MULDER等[9]2018年对欧洲6个国家动植物源性食品中吡咯里西啶生物碱的污染水平进行调查，92%的（草药）茶均检出PAs，且浓度高，平均浓度可达460μg/kg（干茶）。欧洲食品安全局（EFSA）调查结果已表明，（草药）茶等物质是人体暴露PAs/PANOs的重要来源之一[10]。2020年已设定茶叶中PAs最高含量为150μg/kg（成人）与75μg/kg（婴幼儿）。茶饮料是指以茶叶的萃取液、茶粉、浓缩液为主要原料加工而成的饮料，具有茶叶的独特风味与特征性成分的多功能饮料。鉴于茶叶受到PAs污染，以茶叶为原料的深加工产品可能成为人体暴露PAs的来源，对人体形成健康风险。CHMIT等[11]分析了使用植物和草药提取物加工制成饮品中PAs的含量，其中24%的利口酒以及67%的草药汁样品呈阳性。PICRON等[12]发现在茶叶简单浸泡过程中，16%～28%的PAs/PANOs从干物质转移到了浸泡液中，但目前对茶饮品中PAs的相关研究与关注较少。此外，据陈红平等[13～14]关于农药浸出率的研究，推测不同茶饮料使用的原料与加工工艺会影响其中PAs的污染水平。PAs的理化性质也会影响其在茶饮料的污染程度。目前茶饮料中PAs污染水平尚不清楚，有待于开展茶饮料中PAs污染水平研究。

复杂基质中PAs检测技术随着常量定性分析向痕量残留定量分析的方向发展，对基质中PAs的检测经历了分光光度法[15]、核磁共振法[16]、免疫学方法[17]等定性定量分析方法，逐渐提升到色谱法和色谱质谱联用精准分析技术[4]。色谱与质谱联用技术在PAs分析中选择性好、灵敏度高，且适用于同时检测多种PAs，因而适用于农产品或食品中PAs的定性定量分析[1，3]。与气相色谱－串联质谱（GC－MS/MS）相比，液相色谱串联质谱联用（LCMS/MS）因具有高灵敏度、检测限低、适用范围广、重复性好、操作方便、前处理简单等优点，已成为目前PAs检测方法中最主流的检测手段。食品中PAs前处理技术主要包括液液萃取法（LLE）、固相萃取技术（SPE）[18]、QuEChERS法[19]以及发展的新型技术如分散液相微萃取（DLLME）[20]、固相支持液/液萃取（SLE）[21]等。其中SPE具有溶剂用量少、高效、快速的特点，是最常用的净化处理方式[3～4]。本文采用SPE前处理方法，超高效液相色谱－串联质谱（UHPLC－MS/MS）技术检测茶饮料中PAs；通过分析市售28款茶饮料中PAs的含量，分析茶饮料中PAs污染水平，以期为保障食品安全提供参考。

一、实验方法

（一）实验仪器与材料AB SCIEX TQ 5500型串联三重四极杆质谱仪（美国SCIEX公司）；LC－30A超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Milli－Q超纯水系统（美国Millipore公司）；DMT－2500自动振动仪（杭州米欧仪器有限公司）；高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。

15种PAs/PANOs包括天芥菜碱（He）、天芥菜碱－N－氧化物（HeNO）、倒千里光碱（Re）、倒千里光碱－N－氧化物（ReNO）、千里光宁碱（Sc）、千里光宁碱－N－氧化物（ScNO）、千里光碱（Jb）、千里光碱－N－氧化物（JbNO）、促黑激素（Im）、促黑激素－N－氧化物（ImNO）、千里光菲灵碱（Sp）、千里光菲灵碱－N－氧化物（SpNO）、欧天芥菜碱（Eu）、欧天芥菜碱－N－氧化物（EuNO）和克氏千里光碱（Sk）均购自PhytoLab（德国）。用甲醇（MeOH）制备每种PAs/PANOs的储备溶液 为1 mg/mL，避 光 于－20℃储 存。甲醇（MeOH）、氢氧化铵、甲酸（FA）、甲酸铵（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）；硫酸购自昆山金城试剂有限公司 （苏州，中国）；Bond Elut Plexa PCX色谱柱（200 mg/6 mL）购自安捷伦科技（美国）。实验用水为超纯水（Milli－Q水处理系统制备）。实验材料使用的28款茶饮料包括红茶饮料、绿茶饮料、普洱茶饮料、果茶以及奶茶等，均购买自浙江省杭州市超市。

（二）样品前处理采用SPE柱（Bond Elut Plexa PCX，200 mg，6 mL）进行固相萃取净化。先后采用5 mL甲醇与5 mL去离子水活化SPE柱，取10 mL茶饮料分两次加入到PCX SPE柱；待上样液的液面与SPE上层齐平时，分别采用5 mL去离子水（含1%甲酸）与5 mL甲醇进行淋洗，再采用4 mL甲醇（含0.5%氨水）洗脱；洗脱液经0.22 μm滤膜于自动进样瓶，待UHPLC－MS/MS分析。

（三）色谱-质谱条件UHPLC－MS/MS色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（2.1mm×100 mm，1.8μm），流动相A为1mmol/L甲酸铵的甲醇（含0.1%甲酸），流动相B为1mmol/L甲酸铵的水（含0.1%甲酸），洗脱梯度见表1。流速为0.25 mL/min，柱温40℃。进样量3μL。

表1 UHPLC-MS/MS流动相洗脱梯度

UHPLC－MS/MS质谱条件：正离子电喷雾电离（ESI+），可编程多反应监测（sMRM）模式监测，MRM参数见表2。ESI气体温度为500℃，离子喷雾电压（IS）为5 500 V。气帘气（CUR）和碰撞气（CAD）的压力分别设置为35 psi和7 psi。雾化气压力（GS1）和辅助气压力（GS2）均设置为50.0 psi。

表2 15种PAs保留时间及MRM参数

二、结果与讨论

（一）方法线性范围、检出限、定量限以15种PAs/PANOs的峰面积为纵坐标，目标化合物浓度为横坐标，考察目标物的线性，结果如表3所示，可以看出，15种化合物分别在0.1～200μg/L范围内线性关系良好（R2＞0.99），检出限（LOD，S/N＝3）为0.001～0.05μg/L。方法的定量限通过最低水平加标回收率的方式获取，最终确定15种目标物定量限（LOQ）范围为0.1～0.8μg/L，表明本方法灵敏度高，可满足对PAs检测方法灵敏度的要求。

（二）方法的回收率与精密度茶饮料样品中15种化合物分别在1、5、10μg/L的加标浓度下，按照上文前处理方法进行样品前处理，方法的回收率与精密度如表3所示。15种目标物回收率范围为68.7%～96.4%，相对标准偏差（RSD）＜11.5%。结果表明，本方法准确度高，重复性良好，且适用于茶饮料基质中15种PAs的定量。

（三）基质效应（Matrix Effects，ME）采用甲醇溶剂标准样品溶液和茶饮料基质样品溶液进行基质效应评价，用ME＝［（kmatrix/kmethanol）－1］×100%（k为标准曲线斜率）公式计算，最终得到茶饮品中PAs的基质效应范围为－0.45～0.08。不同PAs在茶饮料中基质效应有差异，如表3所示，茶饮料对大多数PAs有较弱基质抑制效应，只有Sc有较弱的基质增强效应，此外，茶饮料对SpNO表现出较显著的基质抑制效应。

表3 15种PAs/PANOs在茶饮料基质中的准确度、相对标准偏差、线性方程和相关系数等

（四）茶饮料中PAs污染水平采用本文方法监测了从市场中收集的常见茶饮料样品28份，其中包括花果茶、奶茶以及纯茶制品。监测结果如表4所示，所有茶饮料样品中均能检出1种或多种PAs，其中有2个样品中的Sk含量大于定量限，其余样品中检出PAs含量仅高于检出限但小于定量限。结果表明，茶饮料中PAs污染范围广，但因其中PAs含量较低，其总体污染程度较低。与欧盟调查茶叶中的PAs结果相比[22]，此次监测的茶饮料中PAs污染程度明显低于欧盟市售茶饮料。

不同种类茶饮料PAs污染水平有差异，如表4所示，有1个样品（7号样品）中可以检出12种PAs，虽含量均小于定量限，但其中含有多种类型PAs。有7.14%的样品中分别检出7种PAs，检出5～6种PAs的样品共有4个，大多数样品（64.29%）中检出PAs种类为1～2种。不同茶饮料中PAs污染程度差异主要可能与原料以及深加工工艺有关。此外，监测样品中检出PAs含量较高的样品一般属于果茶，考虑到这可能与茶饮料所使用茶叶原料等级有关。

表4 28款市售茶饮料中PAs/PANOs含量监测结果

茶饮料中15种PAs检出率结果如图1所示，可以看出，在28款饮品中所有目标物均有检出，不同PAs检出情况不同。Sk的检出率最高，可达92.86%，且有两个茶饮品中的Sk含量高于检出限；其次检出较高的是JbNO、ImNO、Eu及EuNO，其检出率均在20%以上，其余PAs检出率较低。此外，PANOs在茶饮料中的检出率普遍高于PAs，这可能与PANOs的理化性质有关，推测其极性大，在加工过程中易被提取。

图1 茶饮料中15种PAs/PANOs检出率

三、结论

本文建立了UHPLC－MS/MS同时检测茶饮料中15种PAs/PANOs的方法，该方法简便、快速，灵敏度高，重现性好，满足茶饮料中15种PAs/PANOs污染检测的要求。本研究应用该方法监测了28款市售茶饮料中15种PAs的含量，结果表明，茶饮料中PAs污染程度较低；不同茶饮料中PAs污染水平存在较大差异，推测可能与原料与加工工艺有关。该研究有利于进一步查明茶饮料中PAs对人体的暴露水平，为茶饮料中PAs风险评估提供基础数据。