四次跨膜蛋白CD81在胶质瘤组织中表达水平及其与预后关系

刁正文， 张华军， 陈 卉， 张德明， 李秋霖， 张 杰

雅安市人民医院 神经外科，四川 雅安 625000

胶质瘤是较常见的颅内肿瘤，预后较差。四次跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily，TM4SF)是一类小分子跨膜蛋白，分子量20～30 kDa，几乎存在于所有组织和真核细胞中[1]。TM4SF可与细胞表面分子如生长因子受体、免疫球蛋白超家族和整合素等结合形成四跨膜蛋白网络，从而调节细胞信号转导，介导细胞增殖、分化、粘附和迁移等生理过程[1-2]。CD81是TM4SF中的重要成员，广泛表达于乳腺、肺、前列腺、大脑和淋巴结，可能会成为潜在的肿瘤治疗靶点[3]。关于CD81在胶质瘤中的表达及意义的研究较少，二者之间的关联性尚不明确。本研究对胶质瘤组织和正常脑组织中CD81基因和蛋白的表达水平进行检测，旨在探讨四次跨膜蛋白CD81在胶质瘤组织中的表达及其与预后的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集自2011年6月至2014年6月雅安市人民医院手术切除的114例脑胶质瘤组织纳入胶质瘤组，另选取同期48例脑外伤后行颅脑损伤内减压术中切取的正常脑组织纳入正常组，两组术前均进行卡氏评分。所有患者术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗。胶质瘤组：男性61例，女性53例；年龄范围25～75岁，年龄(55.09±11.23)岁；世界卫生组织(World Health Organization，WHO)分级[4]Ⅱ级36例、Ⅲ级47例、Ⅳ级31例；病理类型为星型胶质瘤51例、少突胶质瘤32例、室管膜瘤12例、混合胶质瘤19例；额叶肿瘤78例；手术为部分切除50例，全切64例；术后化疗64例。正常组：男性27例，女性21例；年龄范围29～58岁，年龄(52.90±10.12)岁。所有组织标本均冻存于-70℃深冻冰箱。

1.2 研究方法

1.2.1 逆转录-聚合酶链反应检测组织中CD81 mRNA的表达 随机选取不同级别胶质瘤组织与正常脑组织各12例进行检测。聚合酶链反应引物均由杭州沃森生物技术有限公司设计并提供。CD81：上游5′-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′；下游5′-GGTCCTGCACCAGTAATATGCA-3′。内参GAPDH：上游5′-GAGTCCACTGGCGTCTTC-3′；下游5′-GATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′。取组织50 mg，用总RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取RNA，随后转录为cDNA，以GAPDH为内参。用荧光定量聚合酶链反应试剂盒检测CD81 mRNA的相对表达量。聚合酶链反应条件为：95℃ 20 s、95℃ 10 s、60℃、20 s，共40个循环。用2-ΔΔCq法计算基因相对表达量。

1.2.2 蛋白免疫印迹法检测组织中CD81蛋白相对表达量 随机选取不同级别胶质瘤组织和正常脑组织各12例进行检测。取组织100 mg，加入蛋白裂解液。用BCA法检测蛋白浓度，随后取50 μg组织蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，将蛋白转至PVDF膜上。用脱脂奶粉封闭1 h，加入抗CD81和抗内参GAPDH抗体(均购自圣克鲁斯生物技术有限公司)，4℃温育过夜，弃去一抗，TBST缓冲液洗膜3次。室温孵育抗IgG二抗2 h，弃去二抗，TBST缓冲液洗膜3次。用ECL发光仪对蛋白成像，用Image J软件分析灰度值。

1.2.3 免疫组织化学染色法检测组织中CD81的表达水平 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase,SP)法检测所有组织中CD81的表达水平。本研究所用石蜡切片均由病理科制备，厚度4 μm。使用时，60℃下烤片30 min，脱蜡处理。加入柠檬酸钠缓冲液修复抗原，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，5%羊血清封闭30 min，加入抗CD81抗体，4℃过夜。加入生物素标记二抗，37℃孵育30 min，随后DAB显色。苏木紫复染。经脱水、透明、封片处理后，在显微镜下观察。每张切片随机取10个视野，每个视野计数100个瘤细胞，根据细胞的染色强度及阳性细胞比例判断CD81表达情况。染色强度评分：0分(阴性)，1分(弱阳性，染色为浅黄色)，2分(中度阳性，染色为棕黄色)，3分(强阳性，染色为棕褐色)。阳性细胞比例评分：1分(0～10%)，2分(11%～50%)，3分(51%～80%)，4分(81%～100%)。将两个得分相乘得出最终结果：0～3分为低表达，4～12分为高表达[5]。

1.2.4 术后随访 术后以电话和门诊方式对所有胶质瘤患者进行随访，术后第1年每3个月随访1次，随后每6个月随访1次。记录患者总生存期，定义为术后第1日至死亡或末次随访时间。随访截止2018年1月。

2 结果

2.1 逆转录-聚合酶链反应检测胶质瘤组织中CD81 mRNA的表达 胶质瘤组织中CD81 mRNA相对表达量明显高于正常脑组织，且随着胶质瘤WHO分级的增高，CD81 mRNA相对表达水平逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 正常脑组织与胶质瘤组织中CD81 mRNA相对表达量

2.2 蛋白免疫印迹法检测胶质瘤组织中CD81的蛋白表达水平 胶质瘤组织中CD81蛋白相对表达量明显高于正常脑组织，且随着胶质瘤WHO分级的增大，CD81蛋白相对表达水平逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 正常脑组织与胶质瘤组织中CD81蛋白相对表达量

2.3 免疫组织化学法检测胶质瘤组织中CD81表达水平 免疫组织化学检测结果显示，正常脑组织中CD81少量表达，而胶质瘤组织中CD81阳性表达较高(图3)。正常脑组织中CD81高表达率为18.8%(9/48)、WHO Ⅱ级胶质瘤组织CD81高表达率为25.0%(9/36)、WHO Ⅲ级胶质瘤组织CD81高表达率为44.7%(21/47)、WHO Ⅳ级胶质瘤组织CD81高表达率为74.2%(23/31)，随着WHO分级的增高，CD81阳性表达率逐渐增大(Z=-5.052，P<0.05)。

图3 免疫组织化学法检测胶质瘤组织中CD81表达水平(SP法染色×200)

2.4 胶质瘤患者总体生存时间的影响因素分析 COX因素分析结果显示，术前卡氏评分<80分、WHO分级为Ⅲ～Ⅳ级、CD81高表达是胶质瘤患者总体生存时间较低的独立影响因素(P<0.05)。见表1。

表1 胶质瘤病人总体生存时间的单因素和多因素分析

2.5 CD81表达与患者生存预后的关系 CD81低表达与高表达胶质瘤患者的中位生存时间分别为18个月、11个月。CD81高表达患者的总体存活率明显低于低表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 CD81表达水平与中位生存期的关系

3 讨论

神经胶质瘤是较常见的脑部恶性肿瘤，症状主要包括视力丧失、恶心、呕吐、四肢无力、头痛和癫痫等[6]。胶质瘤患者的存活率较低，生存预后较差，确诊后1年存活率约50%，2年存活率约25%，中位生存时间仅为9～12个月[7]。目前，手术与放疗、化学疗法联合是临床上治疗胶质瘤的主要方法，但胶质瘤的发生发展机制尚不完全明确。因此，寻找胶质瘤的生物学标志物，预测潜在的治疗靶标成为临床研究的热点[8]。

TM4SF蛋白家族可直接或间接作用于细胞信号传导途径，参与细胞的粘附、增殖、侵袭和迁移等，从而影响肿瘤的发生、发展及血管形成[2]。CD81是具有多种生物学活性的TM4SF家族成员之一，在机体广泛分布，且参与多种生理应答反应。CD81与肿瘤的侵袭和转移密切相关，在多种疾病中均可见其异常表达，如子痫、艾滋病和癌症等[3,9]。Yuan等[10]研究提示，CD81可促进肿瘤转移，而蛋白酪氨酸磷酸酶2可以通过相互作用抑制CD81的表达，从而减少大肠癌的恶性演变。Liu等[11]研究发现，CD81在食管癌细胞中的表达明显高于正常食管上皮细胞，干扰食管癌细胞中的CD81高表达水平可降低癌细胞的侵袭能力，上调E-cadherin蛋白的表达，提示CD81的高表达水平可能促进肿瘤发生、发展。有研究发现，CD81在膀胱癌细胞T24和J82中高表达，可能通过ERK信号通路增加基质金属蛋白酶的表达，进而促进癌细胞的侵袭[12]。Zhang等[13]研究发现，CD81在乳腺癌组织和细胞中高表达，且CD81与乳腺癌淋巴结转移有关，下调CD81基因可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。有研究发现，CD81的低表达水平可抑制浆细胞性骨髓瘤细胞的迁移和侵袭，提示低水平CD81是浆细胞性骨髓瘤细胞转移的抑制剂[14]。此外，Paiva等[15]研究表明，CD81的高表达水平是提示有症状浆细胞性骨髓瘤患者预后不良的几个重要因素之一。

本研究发现，胶质瘤组织CD81基因和蛋白的表达水平明显高于正常脑组织，且随着WHO分级的增高，CD81的表达水平也逐渐增高，提示CD81可能参与了胶质瘤的发生。本研究结果提示，CD81高表达水平可能促进肿瘤的发生发展，但本研究并未反向检测下调CD81的表达水平对肿瘤的影响。影响胶质瘤患者预后的因素较多，本研究COX多因素分析结果显示，术前卡氏评分、WHO分级是胶质瘤患者生存预后的独立影响因素，与既往研究结果相似[5,16]。本研究结果显示，CD81高表达是胶质瘤患者不良生存预后的独立影响因素。Log-rank统计结果显示，CD81高表达患者的总体存活率明显低于低表达患者。这提示，CD81可能成为胶质瘤患者预后评价的指标。

综上所述，胶质瘤组织中CD81基因和蛋白的表达水平明显高于正常脑组织，胶质瘤WHO分级越高，CD81的表达水平越高。CD81表达水平增高预示着患者的不良生存预后。本研究亦存在一定局限性。本研究为回顾性研究，可能存在选择偏倚和回忆偏倚；未检测患者血液中CD81的表达水平；未深入分析CD81在胶质瘤中的作用机制。