基于网络药理学探讨中药复方黄连汤治疗胃溃疡的作用机制

杨立波，张 谦，王 丹

（1.巴彦淖尔市医院消化内科，内蒙古 临河 015000；2.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心；3.内蒙古医科大学中医学院）

胃溃疡是最普遍的胃肠道疾病之一，严重影响了人们的生活[1～3]。幽门螺杆菌感染是全世界胃慢性炎症的最常见原因[4～9]。患者口服诸如阿莫西林，克拉霉素和甲硝唑等抗菌药物来治疗感染幽门螺杆菌取得了一定疗效，但与此同时，患者对这些抗菌药物的耐药性也在逐年增加[10，11]。因此，迫切需要开发新的抗幽门螺杆菌的治疗方法，尤其是中草药，复发率低且副作用小[12～15]，易于获得，在很大程度上减轻了患者的经济负担。

中药复方黄连汤来源于《圣济总录》卷一七八，由黄连，干姜，艾叶和乌梅四味中药组成，具有平调寒热，和胃降逆的功效，本研究以网络药理学为工具和实验方法，探究黄连汤治疗胃溃疡的的活性成分和主要作用靶标，为其下一步机制作用的研究和实验验证打下基础。

1 方法

1.1 黄连汤化合物成分收集

在Pubmed，中国知网和中药系统药理学分析平台（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中检索：黄连、干姜、艾叶、乌梅，以OB≥30%（oral bioavailability，生物利用度）和DL≥0.18（drug-likeness，类药性）筛选黄连汤潜在活性成分以及这些活性成分所对应的可能靶点，根据Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）对黄连汤潜在活性成分以及这些活性成分所对应的可能靶点的名称进行缩写标准化。

1.2 胃溃疡发病机制相关的疾病基因的收集

在Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）两个疾病数据库中以“gastric ulcer”为关键词检索与胃溃疡发病机制相关的基因，对两个疾病数据库里筛选得到的基因进行整合，剔除重复基因，查阅文献删除无关基因，最后整理得到与胃溃疡发病机制密切相关的疾病基因。

1.3 黄连汤-胃溃疡交互靶点的获取

将1.1和1.2中整理得到的txt文件导入R语言平台，按照事先写好的程序运行R软件后得到黄连汤-胃溃疡交互靶基因，利用交互靶基因绘制韦恩图。

1.4 黄连汤复方调控网络构建

运行R软件后得到黄连汤-胃溃疡交互靶基因，将此交互靶基因txt文件导入Cytoscape 3.8.0，然后对黄连汤成分以及作用靶点等属性进行标示，运行软件，调整修饰后导出黄连汤复方调控网络。

1.5 构建黄连汤-胃溃疡蛋白互作网络

将黄连汤-胃溃疡交互靶基因txt文件导入STRING在线网络数据库（http：//string-db.org/cgi/input.pl），相互作用评分阈值＞0.900，研究对象选择人种，对于网络脱节的游离基因进行隐藏，导出黄连汤-胃溃疡蛋白互作网络和string_interactions文件。

1.6 通过蛋白相互作用网络获取核心基因

将1.5中获得的string_interactions导入Cytoscape 3.8.0软件中，利用cytoNCA插件对BC（betweenness）、CC（closeness）、DC（degree）、EC（eigenvector）、LAC（local average connectivity-based method）进行两次打分，根据得分大于中位值的基因，筛选作为PPI网络核心基因。

1.7 GO与KEGG通路富集分析

将黄连汤-胃溃疡交互靶基因txt文件导入R平台进行GO数据库与KEGG数据库富集分析。富集分析皆以P＜0.05为筛选标准。

2 结果

2.1 黄连汤化合物成分收集

通过Gene Card、OMIM数据库中检索到5148个胃溃疡相关靶点基因。运用R语言得到药物-疾病交互靶点148个（见图1）。

图1 黄连汤-胃溃疡交互靶点韦恩图

2.2 中药复方调控网络构建

此网络中有23个主要化合物成分，有148个胃溃疡疾病靶点（见图2）。主要化合物成分及作用靶点图如表1所示。

图2 化合物-靶标网络

表1 主要成分及靶点

2.3 PPI网络的构建及其网络核心的筛选

PPI网络如图3A所示。经过两次打分BC≥66.977486385，CC≥0.2036639875，DC≥6，EC≥0.0363098645，LAC≥2，NC≥3.05和BC≥15.40516585，CC≥0.526315789，DC≥8，EC≥0.122935086，LAC≥4，NC≥5.219516595，根据得分大于中位值，最终共筛选出网络核心基因15个，分别为TP53、CDKN1A、AKT1、HIF1α、FOS、MYC、JUN、EGFR、NR3C1、MAPK1、RB1、CCND1、ESR1、RELA、MAPK8（见图3C）。

图3 PPI网络核心基因

2.4 GO数据库富集分析

运用R软件将黄连汤-胃溃疡交互靶基因进行GO数据库富集分析（见图4），GO数据库富集分析共计2412条，包括2152条生物学过程（biological process，BP），190条分子功能（Molecular Function,MF）和70条细胞成分（cellular component，CC）。设定P＜0.05为阈值标准进行过滤，按照P值由小到大分别选取生物学过程、分子功能和细胞成分中前10条通路绘制GO通路图。

图4 GO富集分析

2.5 KEGG富集结果分析

运用R软件将黄连汤-胃溃疡交互靶基因进行KEGG数据库通路富集分析，总计得到160条涉及黄连汤-胃溃疡相关信号通路，设定P＜0.05为阈值标准进行过滤，按照P值由小到大选取前30条通路绘制KEGG信号通路图（见图5）。

图5 KEGG富集分析

3 讨论

本研究筛选到的黄连汤治疗胃溃疡的主要活性成分为黄连碱、β谷甾醇、山柰酚、槲皮素等，均具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增强机体免疫等多种药理作用，说明这几种化合物可能是黄连汤治疗胃溃疡的物质基础。

通过疾病-成分-靶点网络和PPI网络分析发现TP53、CDKN1A、AKT1、HIF1α、EGFR可能是黄连汤治疗胃溃疡的关键靶点。TP53信号通路异常激活可能是其对酒精和阿司匹林致胃溃疡损伤保护作用的重要机制之一。CDKN1A作为细胞内信使调节细胞的增殖与胃溃疡甚至胃癌直接相关。Akt信号通路在大鼠胃溃疡的发生和愈合过程起到关键作用。HIF-1α被确定为与幽门螺杆菌感染激活的细胞周期停滞传递的介体。EGF基因与受体EGFR在特定细胞表面相互作用并且结合后，能够激活一系列细胞级联反应，从而促进细胞增殖和迁移达到增加伤口愈合的作用。同样的，EGF受体所介导的下游Ras/Raf/ERK1/2信号通路，也在特定类型的细胞增殖过程中发挥关键作用。

GO分析结果显示，黄连汤治疗胃溃疡涉及的生物学过程主要包括对氧化应激、脂多糖及活性氧等于氧化应激相关的反应，这些反应均与免疫和炎症相关。KEGG富集分析发现，PPI网络的关键靶点主要富集于AGE-RAGE、TNF、IL-17、P53、HIF-1等与免疫、炎症反应调节相关的信号通路。因此，我们推测，药物有效成分可能通过AGE-RAGE、MAPK、P53、HIF-1等炎症信号通路以及Ras/Raf/ERK1/2通路上的不同靶点来达到治疗胃溃疡的目的。

综上所述，黄连汤在“多成分-多途径-多靶点”协同调控的背景下发挥治疗胃溃疡，并起到抗氧化、抑制炎性反应、调节免疫等多种生物学作用。与此同时，由于网络药理学只是网络大数据的整合和统计，因此，在一定程度上具有局限性，只能作为续基础的理论阶段。在下一步的研究中心，我们将会围绕网络药理学中得到的黄连汤活性成分、作用靶点及治疗胃溃疡相关信号通路作进一步实验验证，从而为黄连汤治疗胃溃疡提供可靠的科学依据，也为后续治疗胃溃疡药物研发打下基础。