贵州道地药材杜仲内生真菌的分离及鉴定

陈晓芳， 李明健

(毕节医学高等专科学校， 贵州毕节 551700)

引言

【研究意义】杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是杜仲科(Eucommiaceae)杜仲属(Eucommia)植物，为我国特有的药用树种，是国家二级保护植物[1]。杜仲植株中含有松脂醇二葡萄糖苷(PDG)、绿原酸、桃叶珊瑚苷、槲皮素、山奈酚等丰富的化学物质，在抗菌、抗肿瘤、治疗心脑血管疾病、抗衰老、增强免疫力、安胎等方面有药理活性[2-3]。植物内生真菌是指其生活史或生活史中的某个时期生活于健康植物组织或细胞间隙中，而对宿主植株本身没有明显病害症状的真菌[4]。【前人研究进展】目前，许多研究者已从杜仲内生真菌发酵产物中检测到与杜仲相似药效的活性物质，如PDG、绿原酸、黄酮类等，这些成分是评价药用杜仲药材质量的重要指标[5]。道地性是中药药材的重要特点，道地药材离不开其特有的生态环境[6]。杨娟等[7]研究表明，杜仲内生真菌群落组成与杜仲的活性成分有关联。同一种植物在不同生长环境，其内生真菌的多样性及生物活性均有差别，作为构成植物内环境的重要组分，杜仲内生真菌对宿主的生长和代谢产物的积累以及药材品质等方面均产生较大影响[8]。作为道地性药材，不同产地杜仲品质不一，而贵州的杜仲品质好，这与作为杜仲内环境的菌落结构有着不可分割的联系。康传志等[9]研究表明，贵州最适宜种植和生长杜仲的区域是毕节市、大方县等地。【研究切入点】为更好的开发利用贵州杜仲内生真菌资源，目前亟需要解决杜仲与内生真菌相互关系、真菌产生活性物质的机制等方面的问题。【拟解决的关键问题】采用传统组织培养法对贵州采自毕节市和大方县道地药材杜仲进行内生真菌的分离及鉴定，旨在开发有地域特色的杜仲内生真菌资源，为杜仲内生真菌多样性和内生真菌的开发利用等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物来源 杜仲样本采集自毕节七星关区和大方县，选取离地面2 m以上的无病斑新鲜的杜仲枝条，用无菌水反复冲洗干净，晾干备用。

1.1.2 培养基 PDA培养基来自北京奥博星生物技术有限公司(货号02-023)。青霉素-链霉素溶液来自biosharp生物科技公司，有效成分为1 mL含100 000单位青霉素和10 mg链霉素，稀释100倍使用。

1.2 内生真菌的分离

内生真菌分离采用组织块培养法。将表面处理干净的杜仲枝条放在无菌超净台上切段约5 cm，放入75%的医用酒精浸泡3 min，取出后依次用装有无菌水的3个灭菌小烧杯中清洗，然后用无菌水流水冲洗，灭菌滤纸吸干水分。无菌解剖刀剥去枝条两端部分和中间的木质部，取韧皮部将其切成5 mm2的组织块。在每个PDA培养基平皿(含青霉素-链霉素)上分开放置2个组织块倒扣于28℃的培养箱培养3～7 d。

对照试验：1)漂洗液检验法。取最后一次冲洗杜仲枝条的无菌水涂布于PDA平板上，28℃恒温培养3～4 d。2)组织印迹法。将上述表面灭菌处理的完整枝条压入PDA培养基中，使枝条灭菌表面与培养基接触30 min后，移除植物材料，培养基28℃恒温培养3～4 d。观察有无菌落产生，以确保杜仲材料表面灭菌彻底，分离出的真菌为内生真菌。

1.3 内生真菌的纯化、保存

杜仲组织块培养后每天观察，当发现块茎切口处长出菌丝时，立即将菌丝转接到新的PDA培养基上相同条件下恒温培养。在分离过程中根据组织块切口旁长出的菌落形态、颜色差异及生长时间等不同，分别挑取菌落边缘的菌丝至新PDA平板上进行分离培养。后续采用菌丝顶端纯化法进行2～3次的分离纯化，得到纯化菌株。对纯化菌株编号后，转至PDA试管斜面培养基，于28℃培养箱中培养5～7 d，然后放入4℃冰箱保存。

1.4 内生菌株的ITS分子鉴定

采用CTAB法提取内生真菌基因组DNA。采用在真菌ITS测序通用引物对ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行PCR扩增。PCR反应体系共20 μL：ddH2O 12.8 μL，10×Buffer 2 μL，模板DNA 1.0 μL，正反向引物(10 μmol/L，ITS1和ITS4)各1.0 μL，dNTP mixture(2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(2 U/μL)0.2 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，33个循环；72℃延伸10 min。反应结束后PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物纯化后委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。扩增序列用GenBank核酸序列数据库Blast程序进行内生真菌ITS序列的相似性比对分析。

1.5 内生菌株的形态学鉴定

将纯化菌株用打孔器接种到PDA培养基，28℃培养箱中培养15 d，每日固定时间观察并记录菌落生长情况和形态特征。同时做真菌学插片培养和直接制片的方法观察真菌菌丝和孢子的形态结构特征。根据真菌形态特征参考《真菌鉴定手册》并结合真菌ITS序列Blast结果进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 内生真菌分离鉴定

由表1可见，在毕节市杜仲中共分离得到内生真菌93株。根据菌株在培养基上生长的速度、菌丝生长状态变化、产生的颜色等特征，结合显微镜检的菌丝结构和孢子形态等特点，并结合真菌ITS序列进行分类，共鉴定出拟茎点霉属、间座壳属等9属，杜仲内生真菌具有一定的多样性，其中占绝对优势的种群为拟茎点霉属(Phomopsissp.)和间座壳属(Diaporthesp.)，分别占54.83%和26.88%，其次为黑附球菌(Epicoccumnigrum)和黑孢属(Nigrosporasp.)。

表1 杜仲内生真菌的形态特征与分类

2.2 部分内生真菌菌落形态及结构特征

杜仲内生真菌形态多样，其中间座壳(Diaporthesp.)，白色短绒毛，菌落中部黑色突起为载孢体，孢子透明，a为含有2个油滴的α型孢子呈纺锤体状，b为呈线钩状的β型孢子(图1-1)；锐顶炭角菌(Xylariaapiculata)，菌落底层白色长菌毛，表面黑褐色，长出典型的似牙签的细棒状子座，粗糙革质，尖端白色(图1-2)；黑附球菌(Epicoccumnigrum)，菌落为鲜艳的粉红色(图1-3)；刺盘孢属(Colletotrichumsp.)，黑灰色菌落，孢子呈纺锤形或新月形，有或无隔(图1-4)；黑孢属(Nigrosporasp.)，白色菌毛发达，有该菌属典型的黑而大、圆的孢子(图1-5)。

注：1为间座壳(Diaporthe sp.)平板形态(30 d)及孢子(100×)，a为α型孢子，b为β型孢子；2为锐顶炭角菌(Xylaria apiculata)平板特征(30 d)；3为黑附球菌(Epicoccum nigrum)平板特征(15 d)；4为刺盘孢属(Colletotrichum sp.)平板特征(7 d，30 d)及孢子(40×)；5为黑孢属(Nigrospora sp.)平板特征(30 d)及孢子(40×)。

3 讨论

研究分离得到的杜仲内生真菌经拟茎点霉属、间座壳属等9属，占绝对优势的种群为拟茎点霉属，与杨明琰等[10-11]研究结果均不一致，但梁雪娟[8]采自贵州遵义的杜仲分离得到的内生真菌与研究有1个相同点，均为拟茎点霉属和间座壳属为优势种群。表明，不同地域的杜仲内生真菌在种群结构上存在较大差异，优势菌株组成不同，但是贵州遵义和毕节的杜仲内生真菌优势种群相同。表明，药材杜仲的地道性和地理环境有关系。

拟茎点霉属其有性型为间座壳属，目前已知的有900多种，由于其种类多且不同的生长环境和不同的寄主导致其在生态学方面有较大差异。目前，虽对拟茎点霉的生物学特性有较多报道，但至今仍未有该属生物学特性较一致的描述[12]。李爱华等[13-14]研究发现能够产生松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的杜仲内生真菌拟茎点菌属菌株。因此，对杜仲内生真菌拟茎点霉有进一步研究开发的价值。

目前，锐顶炭角菌(Xylariaapiculata)、小光壳属(Leptosphaerulinasp.)和大白栓菌(Trameteslactinea)菌株是从杜仲中分离得到的首次报导小光壳属菌株国内研究极少，仅见该属中花生焦斑病菌(Leptosphaerulinaarachidicola)的报道[15]。同样研究极少的是大白栓菌，该菌作为天麻的萌发菌近年才有相关研究[16]。锐顶炭角菌为炭角菌属(xylariasp.)，是一类有重要研究价值的真菌，目前锐顶炭角菌作为石斛内生真菌已有相关的研究报道[17]。这些分离得到数量较少，相关研究稀缺且为杜仲内生真菌的首次报道，作为杜仲内生真菌资源的一部分，具有进一步研究潜力。

另外，研究分离得到3株粪壳球菌属和4株黑孢属菌株，CHEN等[18]的研究中鉴定为粪壳菌的杜仲内生真菌能够产生和杜仲药用成分一致的绿原酸活性物质；张维瑞等[19]发现1株能够产生绿原酸的杜仲内生真菌，经分子鉴定隶属于黑孢属。其他菌株在杜仲内生真菌中均在相关研究中分离得到。有些菌株不产孢，需结合分子序列Blast结果进行鉴定，可能这些菌在PDA平板上不产生孢子，需要特殊的环境条件才能产孢，也可能在长期与宿主植株共生的过程中，为适应环境在体外培养时不再产孢子或子实体，这些机理需要进一步研究。

4 结论

试验在毕节市杜仲中分离得到的93株杜仲内生真菌，经生态学和分子鉴定为拟茎点霉属(Phomopsissp.)、间座壳属(DiaportheVsp.)、黑孢属(Nigrosporasp.)、粪壳菌属(SordarialesV sp)、黑附球菌(Epicoccumnigrum)、小光壳属(Leptosphaerulinasp.)、锐顶炭角菌(Xylariaapiculata)、刺盘孢属(Colletotrichumsp.)和大白栓菌(Trameteslactinea)共9属，其中占绝对优势的种群为拟茎点霉属(Phomopsissp.)和间座壳属(Diaporthesp.)，分别占54.83%和占26.88%，其次为黑附球菌(Epicoccumnigrum)和黑孢属(Nigrosporasp.)且种群结构特征与目前已有的报道不同，说明杜仲内生真菌资源丰富，且杜仲内生真菌炭角菌属、大白栓菌在我国属于首次报道。