钙磷浓度对白及种子萌发的影响

杨丽丽， 刘 海， 刘 筱， 孔 娇， 莫远琪， 夏 与， 吴明开*

(1.贵州省农业科学院 现代中药材研究所，贵州 贵阳 550006； 2.贵州省农业生物技术重点实验室， 贵州 贵阳 550006； 3.安龙县欣蔓生物科技有限责任公司，贵州 安龙 552400)

引言

【研究意义】白及(Bletillastriata)主要采集其块茎干燥后入药，是兰科白及属多年生草本植物[1]。其性苦、甘、涩，微寒，用药历史悠久，具有收敛止血、消肿生肌等功效，主要用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒和皮肤皲裂等病症[2]，同时也在医药、化工、美容和保健等方面得到广泛应用[3-8]。白及是贵州道地药材，而贵州是典型的喀斯特地貌，基岩中多为可溶性盐类并且极富钙(Ca)，同时土壤中磷(P)多数以难溶态存在，可以被植物直接吸收利用的有效磷含量低。因此，该环境下生长的白及遭受高 Ca、低P的双重胁迫。【前人研究进展】白及种子无胚乳，目前白及组培快繁体系尚不完善[9]，前人主要研究不同激素对白及种子的影响，如赵垚等[10]研究了不同植物生长调节剂对白及种子萌发及生长的影响。周雨等[11]研究了不同激素对白及种子无菌萌发生长的影响。【研究切入点】到目前为止，钙、磷不同浓度对白及种子萌发的影响尚未见报道，研究钙、磷不同浓度胁迫下白及种子的萌发情况，对白及在贵州地区的种植和生产具有指导意义。【拟解决的关键问题】探明高钙、低磷对白及种子无菌萌发的影响，揭示白及对岩溶生境高钙、低磷环境的适应机制，为优化白及组培育苗技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 白及蒴果采于贵州省农业科学院中药材资源圃，原植物经贵阳中医学院何顺志教授鉴定为兰科植物白及(Bletillastriata)。

1.1.2 试剂 碘化钾(分析纯)、五水硫酸铜、磷酸二氢钾，购自天津市致远化学试剂有限公司；硫酸锰，购自重庆茂业化学试剂有限公司；硼酸、乙二胺四乙酸二钠、肌醇、甘氨酸，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸锌，购自天津市大茂化学试剂厂；钼酸钠，购自天津市化学试剂四厂；氯化钴，购自天津市瑞金特化学品有限公司；硫酸亚铁、氯化钙，购自成都市科龙化工试剂厂；VB1、VB6，购自上海山浦化工有限公司；烟酸，购自上海蓝季科技发展有限公司；硝酸钾，购自重广江川化工有限公司；硝酸铵，购自西陇化工股份有限公司；七水硫酸镁，购自成都金山化学试剂有限公司；6-BA，购自如吉生物科技；NAA，购自北京鼎国生物科技有限责任公司。

1.1.3 仪器MLS-3750 日本三洋(SANYO)全自动高压蒸汽灭菌器(上海道萨生物科技发展有限公司)，SW-CJ-1G型单人净化工作台(苏州净化设备有限公司)，尼康体视显微镜SM800N。

1.2 培养基制备及培养条件

MS培养基中加入无水氯化钙3.2 g/L，磷酸二氢钾1.7 g/L。配制缺钙的MS培养基，分别加入1/2倍钙、1倍钙、1.5倍钙、2倍钙、2.5倍钙、3倍钙；配制缺磷的MS培养基，分别加入1/8倍磷、1/4倍磷、1/2倍磷、1倍磷、1.5倍磷；将配制培养基置于121℃条件下高压蒸汽灭菌20 min，冷却待用。

1.3 果实预处理

将流水冲洗成熟未开裂的白及蒴果沥干，在超净台上分别利用75%乙醇溶液、8% NaClO溶液进行表面消毒1 min、10 min，再用无菌水冲洗4～6次[12]，然后用灭菌剪刀在白及硕果上开小口。

1.4 种子培养

将预处理的果实用镊子夹紧蒴果表面，轻轻将粉末状的种子均匀抖落至培养基表面，放置入温度(25±1)℃、光照度1 200 lx、光/暗周期为12 h/12 h的环境下培养。期间观察白及种子形态以及萌动期和发芽期的动态。

2 结果与分析

2.1 白及种子形态

肉眼下白及种子极小，黄褐色。10倍显微镜下呈两端稍尖的纺锤形，中间有一细小椭圆状的胚，无胚乳。30倍显微镜下种子的胚外层具有透明的种皮，种皮为一层薄壁细胞，细胞透明，无内容物[13]，种皮有薄有厚(图1)。

图1 放大10 倍和30 倍的白及种子

2.2 萌动期动态

白及种子接种至培养基后开始吸水膨胀，种胚和种皮膨大。接种5 d时开始明显吸胀，且高钙浓度处理的种子吸胀较快，而低磷浓度对种子吸胀无明显促进作用。接种10 d种子颜色由淡黄色转变为绿色。随着钙浓度的增加白及种子膨胀体积越大(图2)；低磷处理条件下，白及种子也在吸胀，逐渐膨大。但各浓度间无明显差距(图3)。由图2、图3可见，接种10 d白及种皮仍完整，白及种子先经历吸胀作用，待其膨大、转绿后突破种皮。白及种子的胚不断膨大，当接种15 d时，部分种子冲破种皮，发育成圆球茎并不断长大，种皮因此沿着长轴被不断撕开，其他部分保持相对完整。

图2 钙处理播种10 d的白及种子(2×10 倍)

图3 磷处理播种10 d的白及种子(2×10 倍)

2.3 发芽期动态

培养至20 d时，大部分种子已突破种皮，并形成子叶，甚至有的圆球茎尾部长出很细的根。由图4可见，在加入2倍钙、2.5倍钙、3倍钙中的幼苗长出第2片子叶。培养至30 d时，在不同磷浓度的培养基中，1/2磷浓度条件下长出第2片子叶(图5)，而低浓度磷对子叶生长起促进作用。

图4 钙处理播种30 d的白及种子(4×10 倍)

图5 磷处理播种30 d的白及种子(4×10 倍)

3 讨论

白及种子自然条件下萌发率极低，应用和开发繁殖技术体系以保护白及资源及开展规模化生产。试验配制缺钙、磷和钙、磷不同浓度的MS培养基培养白及种子，5 d后开始吸胀，第10天白及种子逐渐膨大，但各浓度间无明显差距。说明，萌发10 d是白及种子的膨胀期，适当增加钙浓度可促进白及种子体积膨大，磷浓度对其影响不大，且高钙、低磷处理的种子均发育较快。随着钙浓度的增加，白及种子的吸胀、萌动、发芽均呈明显促进作用，而在试验浓度范围内，随着钙浓度的增加，促进作用越明显。说明，白及种子对于喀斯特地区高钙环境有较好的适应性。低磷处理时，吸胀、萌动期有促进作用，在发芽期1/2倍磷也促进子叶的萌发。说明白及种子对于喀斯特地区低磷环境同样有较好的适应性。因此，贵州喀斯特地区高钙低磷土壤环境适合白及种子萌发。

4 结论

钙、磷不同浓度的MS培养基接种第5天时白及种子均开始明显吸胀，且高浓度钙对白及种子吸胀有促进作用，而低浓度磷对种子吸胀影响较小；接种第10天不同培养基种子颜色由淡黄色转变为绿色；接种第20天不同培养基大部分种子已突破种皮，并形成子叶，甚至有的圆球茎尾部长出很细的根。在加入2倍钙、2.5倍钙、3倍钙培养基中的幼苗长出第2片子叶；1/2磷培养基中长出第2片子叶。适当增加钙浓度可促进白及种子无菌萌发后子叶生长，且随着钙浓度的增大子叶生长加快；适当减小磷浓度可促进子叶生长。