从兽医化验员技能竞赛分析ELISA试验注意事项

朱国强 陈伟 徐鸿 徐聪 孙圣福*

（1，山东省济南市章丘区畜牧兽医事业发展中心 250200；2，山东省济南市动物疫病预防与控制中心 250100；3，山东省动物疫病预防与控制中心 250100）

兽医实验室承担着动物疫病检测、诊断、动物疫情和免疫状况监测、动物疫病防控科学研究等职责，对动物疫病防控发挥着重要的支撑作用。兽医化验员作为兽医实验室检测人员，操作的规范性直接决定检测结果的正确与否。ELISA 作为兽医实验室常用的检测方法，常用于口蹄疫、猪瘟等疫病的免疫效果检测，也可用于动物疫病的病原检测。为考核兽医系统实验室操作人员的技能，选取ELISA 作为技能考核的一项，主要考查选手对ELISA 试验的基本操作、试验过程中的生物安全以及对结果的判定等内容，从考核结果看基本满意，但也暴露了ELISA 过程中一些不容忽视的细节。

1 样品和材料

1.1 样品

待检血清样品为10 份，含阴性、弱阳性和强阳性3 个不同滴度，由国家口蹄疫参考实验室制备，由省动物疫病预防与控制中心统一编号和致盲；改进型口蹄疫O 型液相阻断酶联免疫吸附试验试剂盒由中国农业科学院兰州兽医研究所提供；酶标仪、移液器等仪器和耗材由山东畜牧兽医职业学院准备和提供。

1.2 判定依据

操作依据《试剂盒说明书》（改进型口蹄疫病毒O 型液相阻断酶联免疫吸附试验）进行。

每份样品满分2 分，检测结果与参考值一致得2 分，检测结果与参考值误差在±1 个滴度范围内得1 分，检测结果与参考值相差超过±1 个滴度不得分。

2 结果

试验从样品稀释开始，到工作液配制、测定OD 值，计算检测数据，判定结果。主要考察选手移液加液的规范性、移液器、酶标仪的规范使用，对温度反应条件、生物安全注意事项及对检测结果正确性的掌握，选手ELISA 得分情况见附表。

附表 选手ELISA 得分情况

3 分析与讨论

总体成绩看，选手得分从68.5～97 不等，分数差近30 分，说明选手之间的差别比较大；中位数为90.5，说明至少一半的选手对于该项技能竞赛结果良好。从各项得分看，选手主要扣分点集中在结果的准确性＞生物安全＞基本操作。

从结果得分情况看，选手得分分差较大，从3～27 分不等，2 位选手得分在10 分以下，结果偏离参考值较大，病毒抗原对照和阴阳性判定出现错误，这可能与操作过程不规范有关，操作不熟练，对该方法没有完全掌握；其余选手得分均在18 分以上，仅有个别样本的结果偏离参考值较大，大多数样本的检测结果与参考值相差1 个滴度以内。

从生物安全得分情况看，大部分选手对实验室生物安全有较高的认识，扣分点主要集中在个别选手，表现在试验过程中口罩拉到口鼻以下，洗板过程中产生的废液没有倒在标识有“生物安全”的垃圾桶中。

基本操作包括工作液（洗涤液、病毒抗原工作液、底物）配制、样本稀释、抗原稀释、加酶标抗体、底物、终止液，基本操作主要是移液的规范性、准确性以及洗涤酶标板后有没有残液，这与检测结果直接相关。从选手操作看，主要集中在移液不规范，移液器与TiP 吸头没有卡紧，导致移液不准确，尤其是使用多道移液器时液面没有处于同一水平线，个别样本移液量不足；加同样液体的顺序没有从低浓度到高浓度；移液器使用完没有调至最大量程，没有放置在移液器架上等；洗涤酶标板后，液体没有拍干，残留有部分液体；拍酶标板没有垂直拍板，有一定角度，导致板孔中的液体上流入到下面的孔中，导致交叉污染。

从ELISA 本身看，该方法是一种免疫检测中最常用的检测方法之一，也是比较成熟的实验室检测方法，检测结果受试剂、人员、仪器设备及环境温度操作过程的影响。试剂质量包括敏感性、特异性和重复性，试剂的运输是否符合试剂盒要求，是否全程冷链，保存是否低温保存，冰箱的温度是否稳定，使用前是否恢复到室温等；人员是否经过专业的技术培训，培训后是否考核上岗，上岗后是否进行过监督；移液器、酶标仪等关键仪器设备是否经过计量认证，精确度是否能达到要求等；操作过程是否严格按照标准或作业指导书的要求执行。ELISA 试验应至少但不仅限于以上因素才能做到检测结果的客观科学。