Nb0.12-TiO2对脑胶质瘤的光热治疗及乏氧微环境的影响

孙 娜，耿 鹏，赵凌舟，龚佳丽，邢 岩，陈志钢，赵晋华

1. 上海交通大学附属第一人民医院核医学科，上海 200080；

2. 东华大学材料科学与工程学院，上海 201620

脑胶质瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，呈浸润性生长，术后复发率高，且易对放化疗产生抵抗，目前临床治疗效果不佳［1-3］。纳米材料二氧化钛（TiO2）是金属钛（Ti）最常见的化合物。既往研究［4］发现，TiO2在正电子核素18F的切伦科夫辐射下可产生大量的活性氧类（reactive oxygen species，ROS），能有效地杀伤肿瘤细胞，具有优异的光动力治疗效果。2017年，Yu等［5］向TiO2中掺杂元素铌（Nb）合成了铌-二氧化钛（Nb0.12-TiO2），发现Nb0.12-TiO2可在近红外光（near-infrared light，NIR）的激发下将光能迅速转换为热能，有潜力用于肿瘤的光热治疗。此外，Cheng等［6］的研究表明，光敏剂用于肿瘤的光热治疗时，或许可以在有效杀伤肿瘤细胞的同时下调低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表达，改善肿瘤的乏氧微环境，进而抑制肿瘤细胞的转移。乏氧是脑胶质瘤微环境的主要特点之一，与脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭、转移和放化疗抵抗密切相关［7-9］。本研究拟初步评估Nb0.12-TiO2对脑胶质瘤的光热治疗效果，并同时探讨其对HIF-1α表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 一般材料

人脑胶质瘤细胞（U87细胞）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，将U87细胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37 °C、CO2体积分数为5%、饱和湿度的培养箱中静置培养。

1.2 试剂与仪器

Nb0.12-TiO2由东华大学纤维材料改性国家重点实验室提供。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇｛1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-［square（polyethylene glycol）］，DSPE-PEG｝购自上海炎怡生物科技有限公司，油酸、十八烯、十八醇、氯化铌购自Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司，四乙醇钛、氯仿、丙酮、甲醇购自国药集团化学试剂有限公司，X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）购自布鲁克（北京）科技有限公司，透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）购自美国FEI公司，电感耦合等离子体原子发射光谱仪（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer，ICP-AES）购自美国Leeman Labs公司，胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲生理盐水（phosphatebuffered saline，PBS）购自美国Gibco公司，细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自东仁化学科技（上海）有限公司，活死细胞双染试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国Sigma公司，引物和实时荧光定量聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）试剂盒购自上海冠泰生物科技有限公司（BioTNT）。激光器购自西安赫胥尔镭得激光科技有限公司，酶标仪购自德国Thermo Fisher Scienti fic公司，激光扫描共聚焦显微镜购自美国Thorlabs公司，PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 Nb0.12-TiO2的制备和表面改性

在连续的干燥氮气流中，将油酸（3 mL）、十八烯（7 mL）和十八醇（20 mmol）混合物加热至130 ℃并保持30 min，去除残存的水汽和氧气。然后将溶液冷却至80 ℃，先后加入四乙醇钛（2 mmol）和氯化铌甲醇溶液（0.4 mmol）。待甲醇完全蒸发后，在30 min内将上述溶液升温至280 ℃以上，并在此温度下保持60 min使纳米晶体生长，溶液变成蓝色。随后，将体系自然冷却至80 ℃，加入适量丙酮，快速离心（5 000 r/min，5 min）后得到深蓝色沉淀，即Nb掺杂TiO2纳米晶。当前驱体中氯化铌和四乙醇钛的摩尔比为20%，使用ICP-AES确定合成的纳米晶样品中的Nb/（Nb+Ti）摩尔比为12.2%，该样品命名为Nb0.12-TiO2。所合成的Nb0.12-TiO2纳米晶表面是油酸配位，不能分散在水中。为了获得亲水性，将20 mg Nb0.12-TiO2纳米晶与50 mg DSPE-PEG分散在10 mL氯仿溶液中，超声10 min后，在室温条件下持续磁力搅拌氯仿分散液，使其缓慢蒸发。随后，将5 mL去离子水加入到脂质膜中并超声处理10 min，将水分散液低速离心（3 500 r/min，20 min）以除去可能形成的大聚集体，高速离心（10 000 r/min，10 min）以纯化可能的过量脂质，最终得到磷脂包裹的纳米晶体（记为Nb0.12-TiO2/PEG）。之后对Nb0.12-TiO2的表征、分散性能和光热转换性能等进行分析。

1.3.2 CCK-8法测定Nb0.12-TiO2对U87细胞的毒性

取对数生长期的U87细胞，以每孔5×103个接种于96孔板上，在37 ℃、CO2体积分数为5%的无菌细胞培养箱内培养过夜，吸弃96孔板各孔内的旧培养基，加入含不同Nb0.12-TiO2质量浓度（0.02、0.10、0.50、1.00、5.00 g/L）的新鲜完全培养基，同时设立PBS对照组和空白对照组，以上各组均设立5个复孔，加样结束后置于37 ℃、CO2体积分数为5%的无菌细胞培养箱中继续静置温育24 h，之后按照CCK-8说明进行测定。以上实验重复3次以确认结果。

1.3.3 活死细胞染色评估Nb0.12-TiO2对U87细胞的杀伤作用

取对数生长期U87细胞，以每孔1×104个接种于6孔板上，在37 ℃、CO2体积分数为5%的无菌细胞培养箱中静置培养过夜，弃去各皿内的旧培养基，加入新鲜的完全培养基，随机分为PBS组、Nb0.12-TiO2组、PBS + NIR组和Nb0.12-TiO2+NIR组，PBS作为对照组，Nb0.12-TiO2组和Nb0.12-TiO2+NIR组的终质量浓度为0.2 g/L，之后继续在无菌细胞培养箱中静置培养4 h，PBS+NIR组和Nb0.12-TiO2+NIR组均以功率密度为1.0 W/cm2的1 064 nm波长NIR照射10 min，之后各组细胞按照活死细胞双染色试剂盒说明进行染色，并置于激光共聚焦显微镜下488 nm处观察各皿内细胞的荧光亮度，在同一放大倍数（×20）下拍摄图像并存储。以上实验重复3次以确认结果。

1.3.4 Nb0.12-TiO2介导的光热治疗对U87细胞HIF-1α基因表达水平的影响

取对数生长期U87细胞，以每孔1×105个接种于6孔板上，在37 ℃、CO2体积分数为5%的无菌细胞培养箱中静置培养过夜，弃去各皿内的旧培养基，加入新鲜的完全培养基，随机分为PBS组、Nb0.12-TiO2组、PBS+NIR组和Nb0.12-TiO2+NIR组，PBS作为对照组，Nb0.12-TiO2组和Nb0.12-TiO2+NIR组的终质量浓度为0.2 g/L，之后继续在无菌细胞培养箱中静置培养4 h，PBS+NIR组和Nb0.12-TiO2+NIR组均以功率密度为1.0 W/cm2的1 064 nm波长NIR照射10 min，之后对各组细胞提取RNA，RTFQ-PCR法评估各组细胞HIF-1α的基因表达水平，引物序列见表1。以上实验重复3次以确认结果。

表1 RTFQ-PCR引物序列

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 Nb0.12-TiO2的表征分析

使用XRD研究TiO2纳米晶的晶相，如图1A所示，纯的TiO2纳米晶和Nb掺杂的TiO2纳米晶样品都显示出同样的衍射峰图形，且所有衍射峰与锐钛矿相TiO2标准卡片［粉末衍射标准联合委员会（the Joint Committee on Powder Diffraction Standards，JCPDS）标准卡片编号为21-1272］的衍射峰匹配一致，表明两者具有相同的TiO2纳米晶。对于Nb0.12-TiO2掺杂样品，并没有发现任何其他杂峰，结果表明，Nb5+离子被成功地掺杂到了TiO2的晶格中，但是因为两种元素离子半径比较接近，所以掺杂并未明显改变TiO2基质晶格。

动态光散射（dynamic light scattering，DLS）结果显示，去离子水中Nb0.12-TiO2的平均动力学直径约为30 nm，最终修饰改性后的Nb0.12-TiO2/PEG的直径约为80 nm（图1B），两者均显示出较小的纳米级水动力学直径。

TEM结果表明，Nb0.12-TiO2样品由直径约为20 nm的纳米颗粒组成，这些小纳米颗粒没有具体的形状（图1C）。Nb0.12-TiO2纳米晶表面是油酸配位，不能分散在水中，而经过改性后的Nb0.12-TiO2/PEG可以很好地分散在水溶液中（图1D），且与本课题组之前已发表的研究［5］报道一致，Nb0.12-TiO2纳米晶的光热转换效率为40.6%，高于典型的半导体。这么高的光热转换效率应归因于Nb掺杂TiO2纳米晶的强近红外吸收和高效的非辐射跃迁。以上结果证实Nb掺杂的TiO2纳米晶体具有优异的光热性能和激光稳定性，赋予其在光热治疗中的巨大潜力。

2.2 CCK-8法检测

Nb0.12-TiO2（0.02～5.00 g/L）与U87细胞共培养24 h后，各组细胞活性均大于90%，与PBS组的组间差异无统计学意义（P＞0.05，图2）。由此可见Nb0.12-TiO2在0.02～5.00 g/L质量浓度范围内对U87细胞无明显的毒性作用。

图2 CCK-8法检测不同质量浓度的Nb0.12-TiO2对U87细胞活性的影响

2.3 活死细胞染色

PBS组、Nb0.12-TiO2组和PBS+NIR组未出现明显的细胞凋亡，而Nb0.12-TiO2+NIR组出现大量细胞死亡（图3），说明Nb0.12-TiO2对脑胶质瘤具有显著的光热治疗效果。

图3 活死细胞染色评估Nb0.12-TiO2对U87细胞的杀伤作用

2.4 RTFQ-PCR实验

Nb0.12-TiO2+NIR组HIF-1α的表达大幅下调，与PBS组（0.52 ± 0.20vs1.00±0.00，P＜0.001）、Nb0.12-TiO2组（0.52±0.20vs0.99±0.07，P＜0.001）和PBS+NIR组（0.52±0.20vs1.01±0.03，P＜0.001）的组间差异均有统计学意义（图4）。

图4 RTFQ-PCR评估Nb0.12-TiO2光热治疗后U87细胞的HIF-1α基因水平

3 讨 论

脑胶质瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，但目前尚无有效的治疗方法。光动力治疗与光热治疗是近年来新兴的治疗方法，因其具有创伤小、治疗时间短且不易产生耐药性等优点而引起了研究者的广泛关注［10-12］。

纳米材料TiO2作为金属钛最常见的化合物，合成简便、结构稳定、价廉易得，且与已经广泛应用于医用植入物的金属Ti相似，具有优异的生物相容性［13-14］。Yamaguchi等［15］将TiO2纳米颗粒与脑胶质瘤细胞共培养3 h后，在紫外光照射下超过90%的脑胶质瘤细胞出现死亡或生长抑制，治疗效果显著。然而紫外光穿透能力弱，且长时间紫外光照射会损伤机体DNA甚至诱发癌变，因而限制了TiO2在脑胶质瘤中的进一步应用。Kotagiri等［4］以正电子核素18F的切伦科夫辐射可激活TiO2的光动力学效应开展研究，体内治疗试验显示纤维肉瘤裸小鼠移植瘤模型的肿瘤体积在18F激发的TiO2的光动力治疗后第3天缩小40%左右，1个月后肿瘤完全消失，4个月后达到完全缓解，说明光动力治疗效果显著。2017年Yu等［5］合成了Nb0.12-TiO2，发现Nb0.12-TiO2在常温条件下NIR光照10 min即可快速升温至50 ℃以上，说明光热转换能力显著优于传统的光敏剂。本研究结果表明，TiO2在掺杂Nb后仍有很高的生物相容性，且Nb0.12-TiO2在NIR照射下可有效地杀伤脑胶质瘤细胞，光热治疗效果显著。

肿瘤的发生、发展与肿瘤微环境的变化密切相关，乏氧是脑胶质瘤微环境的主要特点之一。乏氧不仅使脑胶质瘤自身更具侵袭性，而且与脑胶质瘤的放化疗抵抗密切相关。HIF-1α在细胞内的表达受氧浓度的调节，在常氧条件下，HIF-1α会被快速降解，但在乏氧条件下，HIF-1α保持稳定并进入细胞，激活多种下游基因如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、葡萄糖转运蛋白-1（glucose transporter-1，Glut-1）等的表达，促进肿瘤的生长、增殖和迁移［16-19］。Gillespie等［20］在颅内原位脑胶质瘤模型中利用HIF-1α siRNA抑制HIF-1α的表达，结果发现治疗50 d后肿瘤体积较对照组减少了79%，且HIF-1α的转录靶向分子VEGF、Glut-1的表达也显著降低。由此可见，改善脑胶质瘤的乏氧微环境有利于脑胶质瘤的治疗。本研究结果表明，光敏剂Nb0.12-TiO2在对脑胶质瘤细胞发挥光热治疗作用的同时显著下调了HIF-1α的表达，或可改善脑胶质瘤的乏氧微环境。

综上所述，Nb0.12-TiO2作为一种新型光敏剂，具有优异的光热治疗效果，并可在发挥光热治疗时抑制HIF-1α的表达，改善脑胶质瘤的乏氧微环境，有望在将来用于脑胶质瘤的临床治疗。