跌打万应膏治疗小鼠急性软组织损伤的实验研究∗

甄朋超 戚晴雪 王倩倩 周 乔 王 琦

（1.北京中医药大学附属护国寺中医医院，北京 100035；2.北京市肛肠医院，北京市二龙路医院，北京 100120）

急性软组织损伤是由于人体筋、骨、分肉、脉络受损，属于中医学“伤筋”等范畴［1］，多因扭、挫、跌、打等外部因素所致气血瘀阻而出现肿胀、疼痛、功能受限等症状。若损伤失治、迁延日久会导致筋脉失养，甚至关节屈伸不利，治疗宜舒筋活血，祛瘀通络［2］。在前期研究中，我们从临床角度总结了踝关节急性扭挫伤的临床具体表现特点以及跌打万应膏治疗踝关节扭挫伤的临床优效性及安全性［3］，但对其治疗急性软组织损伤的作用机制研究目前还是空白。本研究从不同载药量跌打万应膏对二甲苯所致的小鼠耳肿胀改善实验、毛细血管通透性实验以及醋酸扭体实验方面探讨跌打万应膏消肿、消炎、镇痛作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取中日友好医院实验动物中心体质量18～22 g，2月龄的雄性SD小鼠，无特定病原体（SPF）级，许可证号：SKXK-京-2020-0008。动物饲养于清洁柜中，喂普通饲料，饲养时温度控制在（20±1）℃，湿度50%左右。

1.2 实验药物 跌打万应膏，由北京中医药大学附属护国寺中医医院制剂室提供，批号Z20053605，规格：每盒30 g。处方：乳香、没药、血竭、当归、川芎、红花、苏木、刘寄奴、土鳖虫、自然铜、制马钱子。配置方法：诸药混匀碾碎为粉，80目筛过滤，加入凡士林共热融化，再加入液体石蜡与樟脑，混匀研磨呈胶状细糊备用。受试物浓度：高剂量组生药粉含量50%，中剂量组生药粉含量25%，低剂量组生药粉含量12.5%。双氯芬酸二乙胺乳胶剂，北京诺华制药有限公司生产，国药准字H19990291，规格20 g/支，双氯芬酸二乙胺含量为1 g/10 g。

1.3 试剂与仪器 紫外分光光度计：7530G（Angilent公司），二甲苯、0.5%醋酸：北京北化化学品有限责任公司。伊文思蓝染色液：上海谷研实业有限公司。

1.4 耳郭肿胀实验 选取雄性小鼠50只，称体质量，随机分为5组，每组10只，分别为模型组，跌打万应膏高、中、低剂量组，对照组。模型组不用药，其他组按体质量各自给药。根据临床用量计算，跌打万应膏给生药量0.05 g/kg体质量，小鼠用量的等效倍数为临床用量的10倍，相当于生药0.5 g/kg体质量，故高、中、低剂量给药量分别为4、1、0.5 g/kg体质量。对照组予双氯芬酸二乙胺乳胶剂，给药量为1 g/kg体质量。各组连续给药3 d，末次给药60 min后，在小鼠左耳郭两面均匀涂抹二甲苯，右耳不涂为正常耳，30 min后将小鼠脱颈椎处死，沿耳郭边缘剪下左、右两耳，用直径为6 mm的打孔器在左右两侧耳相同部位取下圆耳片。计算肿胀度：左右耳片质量之差。肿胀抑制率（%）=（对照组肿胀度-实验组肿胀度）/对照组肿胀度×100%。

1.5 毛细血管通透性实验 选取雄性小鼠50只，称体质量，随机分为5组，每组10只，分别为模型组，跌打万应膏高、中、低剂量组，对照组。模型组不用药，其他组腹部脱毛后连续外用给药3 d（给药剂量同1.4）。末次给药60 min后，小鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝（0.1 mL/10 g）。随后立即腹腔注射0.5%醋酸（0.1 mL/10 g），20 min后脱臼处死。用6 mL生理盐水冲洗小鼠腹腔，吸取腹腔液，3 000 r/min离心15 min，取上清液于紫外分光光度计上590 nm测定光密度OD值，OD值越低，代表抑制血管通透性越强。

1.6 醋酸扭体实验 选取雄性小鼠50只，称体质量，随机分为5组，每组10只，分别为模型组，跌打万应膏高、中、低剂量组，对照组。模型组不用药，其他组按体质量腹部外用给药3 d（给药剂量同“1.4”）。末次给药60 min后，各组小鼠均腹腔注射0.5%醋酸0.1 mL/10 g，观察15 min内小鼠的扭体反应次数。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（x±s）表示。组间比较先检验各组数据是否符合正态分布，符合正态分布数据采用单因素方差分析和独立样本t检验分析，若不符合正态分布则采用非参数检验分析。检验水准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠耳郭肿胀实验结果比较 见表1。与模型组相比，各组肿胀度均有明显降低（P<0.05或P<0.01），说明对照组及跌打万应膏各剂量组均能缓解小鼠耳部肿胀。跌打万应膏中剂量组与对照组相比无明显差异，两者疗效相当，低剂量组、高剂量胀度数值显著高于对照组（P<0.05），说明低剂量组与高剂量缓解小鼠耳部肿胀疗效不如对照组。

表1 各组小鼠耳肿胀程度比较（±s）

表1 各组小鼠耳肿胀程度比较（±s）

注：与模型组比较，∗P<0.05，∗∗P<0.01；与对照组比较，△P<0.05。下同。

组别模型组对照组跌打万应膏低剂量组跌打万应膏中剂量组跌打万应膏高剂量组n 10 10 10 10 10肿胀度（mg）7.76±2.32 3.85±1.67**4.66±2.18*△3.12±2.27**4.79±2.25*△肿胀抑制率（%）-50.38±5.58 39.98±4.73△59.79±5.67 38.27±4.68△

2.2 各组小鼠毛细血管通透性实验结果比较 见表2。与模型组相比，各组OD值均有明显差异（P<0.05或P<0.01），说明均能抑制小鼠毛细血管通透性。跌打万应膏中剂量组与对照组相比无明显差异，两者疗效相当，低剂量组、高剂量组OD数值显著高于对照组（P<0.05），说明低剂量组与高剂量抑制小鼠毛细血管通透性不如对照组。

表2 各组小鼠毛细血管通透性抑制情况及扭体次数比较（±s）

表2 各组小鼠毛细血管通透性抑制情况及扭体次数比较（±s）

组别模型组对照组跌打万应膏低剂量组跌打万应膏中剂量组跌打万应膏高剂量组n 10 10 10 10 10 OD值0.72±0.16 0.44±0.15**0.62±0.14*△0.44±0.15**0.62±0.17*△扭体次数（次/15 min）28.55±2.73 10.32±2.47**22.62±2.13*△8.85±2.36**11.65±2.52*△

2.3 各组小鼠醋酸扭体实验结果比较 见表2。与模型组相比，各组扭体次数均有明显差异（P<0.05或P<0.01），说明均能抑制小鼠毛细血管通透性。跌打万应膏中剂量组与对照组相比无明显差异，两者疗效相当，低剂量组、高剂量组扭体次明显多于对照组（P<0.05），说明低剂量组与高剂量抑制小鼠扭体反应疗效不如对照组。

3 讨 论

急性软组织损伤一种常见的骨科疾病，以皮肤下组织，包括肌肉、韧带、筋膜、肌腱、滑膜、脂肪、关节囊外周神经和血管，但不包括骨折或脱位中的一系列急性挫伤或撕裂为特征［4］。这些组织受到外来或内在的不同致伤因素的作用，造成组织急性破坏和组织生理功能的暂时紊乱而产生损伤。主要临床表现为局部疼痛、肿胀、青紫瘀斑、肢体活动障碍等［5］，给患者的生活和工作带来了很大的不便。

现代医学则认为软组织损伤系创伤引起的急性无菌性炎症，其病理基础是外部因素导致局部皮肤、肌肉、微小血管的破损，甚至可导致肌纤维、胶原纤维的损伤，损伤局部毛细血管的血管壁通透性的升高，大量的血管内液体渗出到组织，从而导致损伤处的肢体及关节处的皮肤肿胀，随着组织的充血和坏死，体内代谢失衡紊乱，人体内的炎症因子被激活，产生大量的炎症因子，由此加重了损伤局部的炎症反应，从而刺激局部神经末梢导致疼痛［6-7］。有些炎症因子如PGE2还能使血管的通透性增加，从而引发组织肿胀，形成恶性循环加重病情的进展［8］。如果治疗不及时，将会逐渐形成程度不同的纤维组织增生及炎性粘连，最后导致受损组织的挛缩和变性［9］，成为慢性软组织损伤。目前西医治疗本病的主要方法一般采取RICE（Rest制动休息、Ice冷敷、Compression加压包扎、Elevation抬高患肢）原则及药物治疗，但往往疗效不佳［10］。

中医学将急性软组织损伤归属于“筋伤”范畴［11］，所谓的筋，是指人体的皮肤、浅筋膜、肌腱、肌肉、韧带、腱鞘、滑膜囊、关节囊、椎间盘及周围神经、血管等相关软组织，各种因素造成上述“筋”发生损害的统称为“筋伤”［12］。筋伤在《医宗金鉴·正骨心法要旨》中被定义为“跌打损伤之症状……多有瘀血，一般情况下内损伤而皮不破”。《素问·阴阳应象大论》云“气伤痛，形伤肿”“瘀结不散，则为肿为痛”。《医宗金鉴》记载“损伤之症，肿痛者乃瘀血凝结作痛也”。皆指因外力强烈作用而引起的气血凝滞等病症，根据中医学对该病发病机理的认识，治法则多采用“结者散之，逸者行之，留者攻之”，多采用活血化瘀、消肿止痛的治则［13］。

中药外用治疗急性软组织损伤，在我国历史悠久，药疗效确切、药力可直达病所，避免对胃肠道刺激及避免肝脏的首过效应［14］，而且大多价格低廉、使用方便，很容易为人民大众所接受［15］。跌打万应膏是清代上驷院绰班处传承下来的一种专门治疗跌打损伤的外用药膏，沿用至今已有上百年的历史，自1955年开始在我院使用至今已有六十余年历史，主用于跌打损伤，外伤瘀血等，临床效果显著［16］。中药外治法在急慢性筋伤的临床治疗也日益引起研究者们的关注，但其作用机制目前仍在不断的探索之中［17］。

二甲苯所致的小鼠耳肿胀试验以及毛细血管通透性实验是目前常用的急性软组织损伤模型［18］。小鼠耳肿胀实验中，二甲苯作为化学致炎剂，能引起P物质释放，导致局部毛细血管通透性增加及炎症细胞的浸润，使组织液外渗，造成耳部急性渗出性炎性水肿［19］。毛细血管通透性实验将致炎剂醋酸注入小鼠腹腔内能引起血管内皮细胞自身的损伤以及组胺、5-羟色胺、缓激肽、前列腺素等的释放，这些炎症介质造成腹腔组织毛细血管扩张、通透性增加［20］。扭体实验是考察动物急性软组织损伤模型所致疼痛的一个重要实验。将醋酸注射到小鼠腹腔后，醋酸可刺激脏器及躯体痛觉感受器，可引起皮下细胞壁以及膈下脏器的炎症反应，小鼠因疼痛而出现以扭体为表现的行为变化，扭体次数越多则疼痛强度越大［21］。

本次实验结果显示，跌打万应膏各剂量组及双氯芬酸二乙胺乳胶剂均可抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀及毛细血管的通透性，而且能减少小鼠因疼痛所致的扭体次数。但在本研究中，跌打万应膏高剂量组及低剂量组的疗效不明显，并没有出现预想的量效正比关系，分析其原因考虑为高剂量组中由于生药粉含量最高而致药膏偏于干硬，当涂抹于小鼠耳部及腹部时贴敷性不佳，加上小鼠活动，药膏易于脱落，从而影响药物的吸收及药效的发挥，低剂量疗效不佳考虑为生药粉含量低，经吸收后未能达到有效血药浓度而致疗效欠佳。中剂量组疗效最佳，与双氯芬酸二乙胺乳胶剂相比无明显差异，表明其均具有良好的消肿、抗炎、镇痛的作用，为临床应用提供了可靠的实验依据及科学理论。