破骨细胞功能调控与骨质疏松症的关系研究

王山林 骆新波 黄煊 王健 徐颂

成骨细胞及破骨细胞均是骨组织的重要组成部分,成骨细胞的骨形成能力以及破骨细胞的骨吸收能力的动态平衡在骨生长、发育、修复及重建中发挥着重要作用［1］。成骨细胞的骨形成能力与破骨细胞的骨吸收能力失衡会诱发骨质疏松症的产生［2］。骨质疏松症的特征表现为骨量丢失,骨密度降低,骨脆性增加,其不仅会增加骨折的发生风险,而且会导致骨骼畸形,胸椎变形,甚至会压迫心肺,出现循环系统及呼吸系统障 碍［3,4］。据相关流行病学数据,65 岁以上人群骨质疏松症患病率达到32.0%,其中男性为10.7%,女性为51.6%,城市地区为25.6%,农村地区为35.3%,其发病率存在一定的性别及地域差异［5］。目前,临床对骨质疏松症的致病机制尚不明确,故本次研究从破骨细胞功能调控入手,探讨破骨细胞功能调控与骨质疏松症发病率之间的关系,现将相关结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究选取2019年6月～2020年 12月就诊于本院并确诊为骨质疏松症的患者92例作为观察组,同时收集本院体检中心健康志愿者48例作为对照组。其中观察组男女比例53∶39,年龄52～75 岁,平均年龄(64.5±7.1)岁。对照组男女比例29∶19,年龄50～79 岁,平均年龄(63.1±7.1)岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。纳入标准：观察组所有入组对象均符合世界卫生组织(WHO)对骨质疏松症的诊断［6］。排除标准：患有严重器质性病变患者、影响骨代谢的自身免疫性疾病以及恶性肿瘤等患者。

1.2 方法

1.2.1 破骨细胞平均数计算 将骨髓巨噬细胞接种含有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的α-最低必需培养基 (MEM)的T75 培养瓶中培养,待细胞汇合度达到70%～80%时,转接至96 孔板中过夜培养。第2 天后,用100 ng/ml 核因子κ-B 配体受体致活剂(RANKL)刺激骨髓巨噬细胞,直至破骨细胞形成。随后,使用2.5%戊二醛固定细胞,并按标准流程进行TRAP 染色,染色完成后,在光学显微镜下观察破骨细胞计数,对于细胞核≥3个的细胞归为破骨细胞,并进行计数。

1.2.2 TRACP 及 Cathepsin K 基因表达量测定 将培养好的骨髓巨噬细胞取出,提取其核糖核酸(RNA),将RNA 反转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA),并采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法获得TRACP 及 Cathepsin K 的Ct 值,使用2-△△CT方法计算每个靶基因的相对表达。

1.2.3 白细胞介素细胞因子分泌水平的测定 留取培养＞2 d 的细胞上清液,将其分装冻存于-80℃冰箱中,采用酶联免疫吸附测定法(ELASA)测定IL-6 及IL-1β 分泌水平,操作步骤按试剂盒标准流程进行。ELASA 试剂盒购自江莱生物科技有限公司。

1.2.4 骨吸收活力测定 将培养好的破骨细胞接种于羟基磷灰石涂覆的96 孔板,2 d 后漂洗并干燥观察羟基磷灰石吸收情况,并用Image J 软件进行骨吸收面积分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS24.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验；相关性分析采用 Spearman 相关分析。P＜0.05 表示差异有统计学 意义。

2 结果

2.1 两组患者间破骨细胞相关指标对比 观察组患者破骨细胞平均数、TRACP 及 Cathepsin K 基因表达水平、IL-6 及IL-1β 分泌水平、骨吸收活力均显著高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 两组患者间破骨细胞相关指标对比 ()

表1 两组患者间破骨细胞相关指标对比 ()

注：与对照组对比,aP＜0.05

2.2 各指标与骨质疏松症的相关性分析 破骨细胞平均数、TRACP 及 Cathepsin K 基因表达分泌水平、IL-6 及IL-1β、骨吸收活力与骨质疏松症呈正相关(P＜0.05)。见表2。

表2 骨质疏松症的相关性分析

2.3 不同指标间的相关性分析 为进一步探明各指标之间的相关性,本研究将TRACP 及Cathepsin K 基因表达水平、IL-6 及IL-1β 分泌水平与破骨细胞平均数进行相关性分析,研究发现IL-6、IL-1β 水平及TRACP、Cathepsin K 基因表达水平均与破骨细胞平均数呈正相关关系(r=0.505、0.286，0.374、0.448,P＜0.05)。

3 讨论

骨组织重建过程的调节主要由成骨细胞的骨形成功能及破骨细胞的骨吸收功能完成,长期过度的骨吸收会导致上述平衡被破坏,进而诱发由于骨吸收增多所引起的一系列疾病［6］。骨质疏松症作为一种骨破坏性疾病,曾有研究表明破骨细胞在骨质疏松症发病过程中起到重要作用［7］。因此,本研究在系统文献调研的基础上,系统对比骨质疏松患者与健康体验者之间破骨细胞相关指标差异,并研究各指标与疾病发生之间的相关性,以期为明确骨质疏松症发病机制,指导该病的临床诊疗提供理论指导与参考借鉴。

研究结果发现,观察组患者破骨细胞平均数、TRACP 及 Cathepsin K 基因表达水平、IL-6 及IL-1β分泌水平、骨吸收活力均显著高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示破骨细胞相关指标在骨质疏松症患者体内高表达。破骨细胞平均数、TRACP及 Cathepsin K 基因表达水平、IL-6 及IL-1β 分泌水平在骨质疏松发生过程中发挥着重要作用。细胞因子分泌量及破骨细胞标志物基因表达水平均与破骨细胞平均数呈正相关关系(r=0.505、0.286，0.374、0.448,P＜0.05)。提示临床可通过评估炎症因子分泌水平或基因表达水平以判定破骨细胞的表达水平,进而评估骨质疏松症的发生风险。此外,有研究发现包括IL-6 及IL-1β 等在内的炎症因子参与破骨细胞的分化及骨吸收功能的调节［8］,为进一步探讨细胞因子在破骨细胞转化和功能改变方面的作用,本研究系统对比了骨质疏松患者与对照组之间炎症因子的分泌水平,研究发现骨质疏松患者的炎症因子分泌水平显著高表达,且其与破骨细胞数量之间呈显著正相关关系(P＜0.05),这提示骨质疏松症骨髓单个核细胞局部分泌的炎症因子异常升高,从而刺激骨髓单核细胞向破骨细胞样细胞转化,并提高已成熟的破骨细胞的骨细胞活力,进而成为导致骨质疏松发生的独立危险因素。

综上,本研究证实破骨细胞功能调控与骨质疏松发生息息相关,建议临床基于研究结果,探讨有效手段抑制破骨细胞表达,进而提高骨质疏松症的临床诊疗效果。