N-乙酰半胱氨酸对纳米细菌致大鼠肾结石形成的影响

方道成，陈立新，王 勇，唐春华，高 强，胡媛媛

(上海交通大学医学院附属松江医院：1.泌尿外科；2.全科医学科，上海 201600)

肾结石是一种常见的泌尿外科疾病，在欧洲发病率约5%～9%，亚洲1%～5%[1]。其发病率和复发率高，以草酸钙结石最为常见[2]。既往人们已经发现氧化应激和炎症反应是肾结石形成的重要环节[3]，但人们对于肾结石的具体形成机制仍未完全弄清，随着研究的深入，人们发现纳米细菌与肾结石的形成有着密切关系[4]，纳米细菌可诱导肾小管氧化应激，促进肾结石的形成。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)作为临床常见药物，是谷胱甘肽合成前体，具有强抗氧化作用，可清除体内已生成的自由基，干扰自由基的产生[5]。因此，本研究采用纳米细菌建立了大鼠肾结石模型，研究NAC对纳米细菌致大鼠肾结石形成的影响，旨在明确NAC对纳米细菌致肾结石大鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器丙二醛(malonaldehyde，MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、草酸(oxalic acid，Oxa)检测试剂盒均购自贵州国康生物制药公司；PCR扩增试剂盒及引物由上海生工生物工程有限公司提供；多功能酶标仪(Bio-tech公司)；JH-722型分光光度计(上海度洋仪器有限公司)。

1.2 纳米细菌分离培养收集2016年9月至2017年9月在上海交通大学医学院附属松江医院实施泌尿外科手术的患者的肾结石标本10例，排除感染、内分泌疾病、多系统结石等患者，采集后置于-80 ℃冰箱保存。将保存的肾结石样本去矿物质处理(1 mol/L HCl，30 min)，然后采用PBS溶液进行中和、洗涤，再碾碎、离心(20 000 r/min，40 min)后，经滤膜过滤，收集滤液1 mL加入PMBI1640培养液(含10%热灭活γ胎牛血清)，于pH为7.4的37 ℃、5%体积分数CO2条件中培养，30 d换液1次。培养后弃上清中培养液，加生理盐水、离心、去上清，加0.5 mL HCl(1 mol/L)，混匀，加入Tris中和、离心、去上清，加入配置纳米细菌混悬液备用。采用16 s RNA特异性引物经聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)鉴定纳米细菌，PCR扩增产物通过凝胶电泳可见1 409 bp处出现目的条带，确定纳米细菌分离培养成功[6](图1)。

M：Marker 2 000 bp；1：空白对照；2、3、4、5、6、7：不同标本扩增出的目的片段。

1.3 动物造模与给药SPF级SD(sprague dawley)雄性大鼠45只，体质量均为180～220 g，由贵州医科大学动物中心提供。动物合格证编号为01901214。通风环境中、标准鼠粮喂养，饮用洁净自来水。

将45只SD大鼠预饲养7 d后，随机分为A组(空白组)、B组(对照组)和C组(实验组)3组，每组15只。B组和C组大鼠均经以尾静脉一次性注射纳米细菌混悬液1 mL制备大鼠肾结石模型，A组大鼠尾静脉注射等量生理盐水。实验组大鼠于第2日腹腔注射NAC[150 mg/(kg·d)]进行干预，同时A组和B组腹腔注射等量生理盐水，每天1次，连续干预4周后，用代谢笼收集24 h尿液，处死小鼠，采集肾脏组织，备用。

1.4 HE染色观察肾组织的病理变化取大鼠左肾，采用40 g/L多聚甲醛固定，进行常规的脱水、透明、包埋和切片，进行HE染色，在光镜下观察组织的病理变化以及肾组织中钙盐结晶形态和结晶量，并进行钙盐结晶量化评分[6]。

1.5 检测指标与方法采集尿液，离心(3 000 r/min，20 min)，全自动生化仪检测尿Ca2+含量，采用高锰酸钾褪色法测定尿Oxa含量，严格按照试剂盒的说明进行操作。取右肾制成10%匀浆，用硫代巴比妥酸法检测MDA；用黄嘌呤氧化酶法检测SOD，严格按照试剂盒的说明进行操作。

2 结 果

2.1 HE染色下肾组织的病理变化与A组相比，B、C两组可见肾小管内结晶沉积，且B组肾小管内结晶沉积较C组明显(图2)。

A:肾组织内无晶体沉积，未见明显病理学改变；B:肾小管内可见大量结晶形成；C:肾小管内可见少量结晶沉积。

2.2 各组大鼠肾脏组织中钙盐结晶积分根据钙盐结晶量化评分标准得出A、B、C组积分平均值分别为1.00±0.00、3.80±0.86、2.33±0.61。3组间总体比较，差异有显著性统计学意义(P<0.001)，进一步行每两组间比较显示：B、C组肾脏组织中钙盐结晶积分均高于A组，且B组高于C组(P<0.05，图3)。

2.3 各组大鼠尿液生化指标3组间总体比较，差异有显著性统计学意义(P<0.001)，进一步行每两组间比较显示：与A组相比，B、C组尿液中Ca2+和Oxa水平较高(P<0.05)；与B组相比，C组尿液中，Ca2+和Oxa水平较低(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠尿液Ca2+、Oxa水平比较

*与A组(空白组)比较，P<0.05；#与A组、B组(对照组)比较，P<0.05。

*与A组(空白组)比较，P<0.05；#与A组、B组(对照组)比较，P<0.05。

2.4 各组大鼠肾组织SOD、MDA水平3组间总体比较，差异有显著性统计学意义(P<0.001)，进一步行每两组间比较显示：与A组相比，B、C组肾组织SOD水平较低、MDA水平较高(P<0.05)；与B组相比，C组肾组织SOD水平较高、MDA水平较低(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肾组织SOD、MDA水平比较

SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；*与A组(空白组)比较，P<0.05；#与A、B组(空白组)比较，P<0.05。

3 讨 论

肾结石是泌尿外科常见的一种疾病，关于泌尿系结石形成的病因学有多种假说，如Randall学说、生物学说等，年龄、肥胖、性别等都可影响结石形成，其具体发病机制尚未研究清楚，肾结石中以草酸钙结石最为常见[7]。人们目前对于肾结石多注重其治疗，而对疾病预防和降低复发却未放在重心上，研究表明术后未予药物干预的草酸钙结石患者复发率明显增高[8]，因此研究人员开始关注降低肾结石的发病率和复发率，以期降低患者痛苦。随着研究的深入，人们发现许多可降低肾结石生成的物质，但临床医生希望能有一种价廉、有效、副作用少且易于获取的药物，因此一些临床药物，如NAC进入到人们视线中。

纳米细菌最早被芬兰科学家所发现，其定义为一种能通过100 nm滤菌器原核微生物。研究发现，纳米细菌存在于95%以上肾结石患者的尿液和结石中，具有独特的矿化能力，可作为活性中心，粘附、侵入并破坏肾集合管的上皮细胞和肾乳头细胞从而形成结晶核心，最终诱发结石形成[9]。相关研究表明纳米细菌可利用自身矿化特性诱导结晶的形成，同时还可以损伤肾小管等肾脏结构，两者相互作用进一步导致结石的形成，而且进一步的研究发现其可能通过诱导肾小管上皮细胞脂质过氧化，导致肾小管上皮细胞损伤与草酸钙蓄积呈时间依赖性，从而损伤肾小管上皮细胞，进而导致肾结石形成[4，10]。相关的动物实验表明对大鼠只需一次纳米细菌尾静脉注射即可成功造模，且与乙二醇、氯化铵灌胃造模所致肾结石成分一致，均为草酸钙结石[6，11]。本次实验选用纳米细菌造模大鼠肾结石模型，以便尽可能地模拟人体生理条件下结石形成条件。

NAC作为呼吸科的常用药物，是一种含硫集化合物的谷胱甘肽的合成前体，在化痰、抗感染、治疗慢性阻塞性肺疾病等方面有着良好的疗效[12]。随着对NAC的了解，研究者发现NAC有着抗氧化作用，可分为直接性抗氧化作用和间接性抗氧化作用，其直接作用是由于硫醇基与清除活性氧间互相作用，而间接抗氧化作用与其作为谷胱甘肽前体的作用有关，导致细胞内谷胱甘肽浓度升高从而发挥抗氧化作用[13]。NAC是谷胱甘肽合成前体，具有调整基因的表达、抗细胞凋亡、抗血管生成等作用，谷胱甘肽是体内一种含硫基最多的化合物，可作用于有机过氧基，发挥清除作用。NAC进入体内后可迅速脱去乙酰基变为半胱氨酸，能结合活性氧使其失效，稳定胞内大分子物质，稳定细胞膜及胞内膜相结构，从而增进谷胱甘肽的抗氧化功能[14]。相关动物实验证实，NAC的抗氧化作用在保护心肌、肾脏组织、肝脏组织也可发挥作用[15-17]。SOD酶是体内一种重要的氧自由基清除剂，能够结合活性氧，当活性氧增多过度破坏体内氧化还原平衡时，就会产生细胞毒性，从而产生MDA，因此MDA的浓度可反应体内氧化程度。

本研究发现，纳米细菌致肾结石大鼠肾脏组织中草酸钙结石明显增加，尿液中Ca2+、Oxa升高，经NAC干预后，肾脏组织中草酸钙结石明显减少，尿Ca2+、Oxa显著下降，肾组织中MDA下降、SOD上升。这提示NAC可能通过降低氧化应激反应而抑制肾结石的形成，这也与国内临床研究结果相符合[18]。当然本研究仍有些许不足之处，首先是实验样本数量较少，可能会导致实验结果存在一定误差；其次对NAC的使用方法仍有待进一步研究。但本研究为NAC在纳米细菌致肾结石的应用中提供了一定的理论支持。