肺炎型肺癌患者支气管肺泡灌洗液微生物菌群特征及其临床意义

张景熙 冯秀敏 范韵鑫 张伟 黄怡 白冲

1海军军医大学附属长海医院呼吸与危重症医学科,上海 200433;2新疆医科大学第一附属医院昌吉分院呼吸内科,昌吉 831100

随着高通量二代测序技术 (next generation sequencing,NGS)的发展,局部微生物菌群在肺部疾病中的作用日益受到关注,已有文献报道,呼吸道及肺微生物菌群的失调可能是囊性纤维化[1-2]、哮喘[3-4]、慢性阻塞性肺疾病[5-6]、支气管扩张[7]等多种肺疾病有关。微生物菌群与消化道、上呼吸道、生殖系统等肿瘤发生发展的关系渐有报道,例如幽门螺杆菌感染是胃癌的主要致病因素之一[8];艾托斯坦巴 (Epstein-Bar,EB)病毒感染与Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌[9]的发生密切相关;伤寒沙门菌感染也已证实与胆囊癌的发生确切相关[10];产基因毒素大肠杆菌 (E.coli)、产肠毒素脆弱类杆 菌 (Enterotoxigenic Bacteroides fragilis,ETBF)和核梭杆菌被认为可促进结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的发展[11]。有关肺癌患者下呼吸道微生物菌群的特征及其在肺癌发病中的作用研究较少[12]。支气管及肺泡腔为非无菌的对外开放结构,是多种微生物重要的栖息环境。尤其当肺癌患者影像表现为肺炎型改变时,下呼吸道的微生物检测通常是进行鉴别诊断的必不可少的项目之一,而此类患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中微生物菌群的研究尚未见报道。本研究利用高通量二代测序平台对初诊为肺炎型肺癌患者的BALF 微生物群落结构进行研究,通过与初诊结节型早期肺癌患者及健康者对比,探讨并分析了肺炎型肺癌患者下呼吸道微生物菌群差异特征及其临床意义,现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性研究。纳入海军军医大学附属长海医院呼吸与危重症医学科2018 年2 至2019年4月收治的病理学检查确诊的初诊肺癌患者20例,男14例、女6例,年龄47～76岁,平均(64.50±7.44)岁。其中肺炎型肺癌(肺炎型)组患者9 例,男6 例,女3 例,年龄56～75 岁,平均年龄 (65.33±7.50)岁,有吸烟史者6 例(66.7%)吸烟指数 (25.83±5.85)包/年,其中腺癌8例、小细胞肺癌1例;结节型肺癌(结节型组)患者11 例,男8 例,女3 例,年龄47～76岁,平均年龄 (61.64±7.46)岁,有吸烟史者7例(63.6%),吸烟指数 (23.57±8.02)包/年,其中腺癌7例、鳞癌2例、小细胞肺癌1例、神经内分泌肿瘤1例。

1.2 选择标准 纳入标准:(1)根据组织病理学确认的初诊肺癌患者;(2)肺炎型肺癌:患者胸部CT 影像学表现为大片状或多发斑片状浸润影且病灶最大径>3 cm、类似于肺炎,除外感染性疾病及阻塞性肺炎,并基于2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌国际多学科新标准组织学明确诊断的肺癌患者[13],肺癌临床分期依国际抗癌联盟 (Union for International Cancer Control,UICC)第七版肺癌TNM 分期标准[14]临床分期为不能接受手术或放疗的Ⅲ期患者以及Ⅳ期患者。(3)结节型肺癌:肺部病灶最大径≤3 cm 且TNM 分期中T1期且无淋巴结及远处转移患者。(4)无活动性肺部感染疾病。排除标准:(1)接受过抗肿瘤治疗,包括放化疗及手术治疗;(2)系统性疾病及先天性疾病(如糖尿病、肝炎);(3)3个月内抗生素使用史,2周内局部抗菌治疗史;(4)妊娠期或哺乳期妇女。随机收集7例健康者作为对照组,年龄30～53岁,平均(42.00±10.66)岁,男4例,女3例,有吸烟史者1例(14.3%)吸烟指数为20包/年。本研究经海军军医大学第一附属医院伦理委员会批准(CHEC2019-061),本研究符合 《赫尔辛基宣言》的原则,所有对象对本研究知情同意并签署知情同意书。3组间性别差异无统计学意义,结节型组和肺炎型组均较对照组年龄大(P<0.05),结节型组与肺炎型组吸烟指数差异无统计学意义。见表1。

1.3 BALF标本采集 肺炎型肺癌组及结节型肺癌患者在行CT 引导下肺穿刺前或手术等有创操作前按照常规术前准备在我院行支气管镜检查。所有患者之前未曾行支气管镜检查。受试者取平卧位,用盐酸利多卡因雾化麻醉及丙泊酚静脉麻醉,经鼻进境,支气管镜到达主要病灶所在叶段时,即开始行支气管肺泡灌洗操作,灌洗完毕后再根据患者病情行刷检或活检等后续操作。选取病灶所在肺叶作为灌洗部位以获取BALF,注入生理盐水100 ml,以小于-100 mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)负压吸引回收灌洗液20 ml后立即取出5 ml放入NGS测序专用EP 管、封口膜封闭管口,-20 ℃冷冻保存通过冰袋冷链转运至实验室行下一步的核酸提取和测序分析。健康者选取右中叶支气管进行灌洗。样本留存及取样保存均由培训过的专一人员完成,并在2 h内送检。

1.4 DNA 测序 取600μl患者的BALF,玻璃珠混合震荡后按照 TIANamp Micro DNA Kit(DP316,TIANGEN BIOTECH,Beijing,China)试剂盒步骤提取DNA。提取后的DNA 超声破碎至200～300 bp大小的片段。采用高通量测序仪器BGISEQ-50/MGISEQ-2000-机器型号行文库构建和测序,使用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段大小,使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)质控DNA 文库浓度,经环化形成単链环形结构。环化后的文库经滚环复制 (Rolling circle amplification,RCA)生成DNA 纳米球(DNA Nanoballs,DNB)。制备好的DNB纳米球加载到测序芯片,使用BGISEQ-50进行测序[2]。

1.5 数据分析 测序数据下机后去除低质量的和长度<35 bp 的数据以获得高质量的数据。通过BWA (BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除[3]。剩下的数据在去除低复杂度reads后与专用 细 菌 (3 446种)、真 菌 (206 种)、病 毒(4 152种)、寄生虫 (140种)4个微生物大数据库比对,获得能够匹配到某种病原体的序列数。将BALF中序列数排名前三的细菌菌种定义为优势细菌。

表1 3组性别、年龄和吸烟指数比较

1.6 统计学分析 采用Graphpad Prism 5统计软件及SigmaPlot 12.0软件对实验数据进行统计分析。正态分布计量资料以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析、组内两两比较采用Bonferroni法,两组样本均数的比较采用t检验,计数资料采用例数 (%)表示,组间比较采用χ2检验, 非正态分布计量资料采用中位数[M(P25,P75)]表达,组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验,采用ROC 曲线检测肺炎型肺癌诊断预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺炎型肺癌、结节型肺癌患者及对照组BALF中细菌总序列、菌属种类、菌种数量比较肺炎型组患者BALF 中检出细菌中位序列数量为9 235 (3 498,30 743),高于对照组 [382 (98,2 508)]及结节型组 [486 (96,780)],差异有体统计学意义(P=0.001及0.001),结节型组与对照组之间差异无统计学意义 (P=0.810)。肺炎型组患者检出中位细菌菌属种类为5 (4.5,8.5)]种,较对照组 [4 (2,5)]及结节型组[2 (2,7)]菌属属种有增多趋势,但组间比较差异无统计学意义;肺炎型组患者检出中位细菌菌种种类分别为[9 (6.5,10.5)]种,肺炎型组较对照组[2 (2,6)]及结节型组[4 (2,7)]细菌菌种增多,差异有统计学意义(P=0.015及P=0.021)。见表2。

2.2 3组BALF中细菌菌属分布比较 27例受试者BALF中共检出29种细菌属,从高到低依次排列为链球菌属16例 (59.3%)、普雷沃菌属14例(51.9%)、丙酸杆菌属9例 (33.3%)、韦荣球菌属7例(25.9%)、奈瑟菌属7例(25.9%)、葡萄球 菌 属7 例 (25.9%)、 嗜 血 杆 菌 属6 例(22.2%)、假单胞菌属4例(14.8%)、梭杆菌属、二氧化碳噬纤维菌属、放线菌属、棒状杆菌属各3例(11.1%)、拟普雷沃属、颗粒链球菌属、孪生球菌属、不动杆菌属、弯曲菌属、埃希菌属、缠结真杆菌属、罗氏菌属、牙龈沟产线菌属、口腔纤毛菌属各2例(7.4%)、结核分枝杆菌复合群、乳杆菌属、拟杆菌属、消化链球菌属、莫拉菌属、博得特菌属、营养缺陷菌属各1例。对检出4个菌属以上的患者占比进行了组间比较,结果显示:肺炎型组和结节型组链球菌属和普雷沃菌属检出率均高于对照组,肺炎型组韦荣球菌属检出率高于结节型组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

2.3 3组BALF 中优势菌菌属序列比较 对肺炎型组患者BALF 中链球菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属、韦荣球菌属、奈瑟菌属、葡萄球菌属、嗜血杆菌属及假单胞菌属的序列数占细菌总序列数百分比与对照组及结节组进行比较,结果显示肺炎型组及结节型组BALF 中丙酸杆菌属 [1.5%(0.1～2.8)、6.0% (3.7～8.6)]所占百分均比低于对照组59.6% (23.4～88.8),肺炎组较对照组差异有统计学意义(P=0.030),见表4。

2.4 3 组BALF 中细菌菌种分布比较 对27 例受试者BALF中细菌进行分析,检出产黑普雷沃菌12 例、痤疮丙酸杆菌6 例、小韦荣球菌5 例、灰黄色普雷沃菌3例、表皮葡萄球菌3例、口腔链球菌3例、肺副血链球菌2例、肺炎链球菌2例、殊异韦荣球菌2例、坦纳拟普雷沃菌2例、大肠埃希菌2例、放线菌2例、奥斯陆莫拉菌、产气肠杆菌、柠檬酸杆菌、溶血孪生菌、牙龈二氧化碳噬纤维菌、颗粒二氧化碳噬纤维菌、假肺炎链球菌、婴儿链球菌、施氏假单胞菌、绿针假单胞菌、非典韦荣球菌、副流感嗜血杆菌各1例。对在三组中均可检出的菌种占比进行比较,发现肺炎型组中产黑普雷沃菌阳性患者8例(8/9,88.9%),较结节型组3 例 (3/11,27.3%) 及 对 照 组1 例 (1/7,14.3%)阳性率增高,差异有统计学意义 (均P=0.01);肺炎型组产黑普雷沃菌序列数为2 392(521.3,11 715)高于对照组 [219 (219)]及结节型组[48 (9,498)],与结节型组相比差异有统计学意义(P=0.0485)。肺炎型组小韦荣球菌优势患者2例、结节型组1例、对照组2例;肺炎型组痤疮丙酸杆菌阳性患者1例、结节型组1例、对照组4 例,组间差异无统计学意义 (P=0.190)。

表2 3组BALF中细菌总序列数、细菌菌属种类、菌种种类比较 [M(P 25,P 75)]

表3 3组BALF中优势菌属分布比较 [例 (%)]

表4 3组BALF中优势菌数细菌属序列比较 [M(P 25,P 75)]

2.5 BALF中细菌序列数、菌属及菌种与结节型肺癌大小相关性分析 结节型肺癌患者肺癌可测量结节平均最大径为 (1.57±0.78)cm,与患者BALF中细菌序列数呈弱正相关,相关系数呈统计学意义(r2=0.418,P=0.031),与细菌属的种类及菌种种类无相关性(P=0.059及0.083),见表5。

2.6 BALF 中细菌序列数预测肺炎型肺癌的价值 根据普雷沃菌属序列数占比为37.29%为临界值,预测肺炎型肺癌诊断的敏感性为88.89%(95%CI:0.517 5～0.997 2),特异性88.89%(95%CI:0.652 9～0.986 2),曲线下面积为0.84 (0.663～1.000),P=0.004 7;根据产黑普雷沃菌序列数263为临界值,预测肺炎型肺癌诊断的敏感度为88.89% (95%CI:0.517 5 ～0.997 2),特异度94.44% (95%CI:0.727 1～0.998 6),曲线下面积为0.92 (0.785～1.000),P=0.000 47),见表6,图1。

图1 普雷沃菌属及产黑普雷沃菌为标记物预测肺炎型肺癌诊断的ROC曲线

表5 BALF中细菌序列数、菌属及菌种与结节型肺癌大小相关性分析

表6 BALF中普雷沃菌属序列和产黑普雷沃菌序列数预测肺炎型肺癌诊断价值

3 讨论

已有文献证实微生物菌群与各类肿瘤的发生发展密切相关,从微生物组学探讨对肺癌发病、诊断或治疗的影响成为肺癌研究的热点之一。有关下呼吸道菌群与肺癌的关系研究相对较少,本研究选择了临床上类似肺炎表现的肺癌患者为研究对象,采用高通量二代测序技术 (NGS)对患者BALF 中细菌DNA 的16S r RNA 进行测序,首次探讨了肺炎型肺癌患者下呼吸道局部微生物菌群的特征,并与结节型早期肺癌及健康者进行了对比,对更全面地认识不同类型肺癌微生物学特征提供了临床参考。作为研究微生物组学的新方法,NGS技术不仅可以快速鉴定出尚不能人工培养的微生物,也可以对样本中含量较低的种属进行准确测序,并具有样本需要量小、速度快、覆盖度高等优点,在精准医学发展中具有重要作用。NGS 技术检测发现,肺炎型肺癌患者下呼吸道细菌数量明显增多,细菌菌属及菌种均较对照组及结节型组增多,提示肺炎型肺癌患者局部细菌呈多样性改变,微生物环境更为复杂。某些细菌数量的增多或减少与肿瘤的发生发展密切相关。已有研究发现肺癌患者痰液或BALF标本中普雷沃菌属、链球菌属、韦荣球菌属丰度表达增高[15-16]。Huang等[16]发现普雷沃菌属在肺癌患者BALF 中占主要成分,其后依次为链球菌属、韦荣球菌属及奈瑟菌属,存在远处转移腺癌患者BALF 中链球菌属丰度低于无远处转移患者,有远处转移的鳞癌患者中韦荣球菌属显著高于未转移者,Lee等发现韦荣球菌属在肺癌患者下呼吸道含量明显增高[17]。既往研究未重点突出呈肺炎型改变的局部晚期肺癌的微生物学特征,本研究则重点比较了这一局部晚期特殊类型肺癌患者的微生物学特征,有研究发现链球菌属、普雷沃菌属、韦荣球菌属、假单胞菌属及二氧化碳噬纤维菌属阳性率显著高于对照组,与既往肺癌研究结果类似,同时发现丙酸杆菌、葡萄球菌、棒状杆菌较健康对照组有降低趋势,下呼吸道菌群的差异化表达再次证实与肺癌的发生发展存在一定关系。当然,还需要进一步扩大样本深入研究。微生物菌群存在着促癌作用或抑癌作用是参与肿瘤发生发展的潜在机制之一。口腔鳞癌患者唾液中链球菌属、牙龈卟啉单胞菌属、厌氧菌嗜二氧化碳噬细胞菌丰度被证实参与口腔鳞癌的发生发展[18],普雷沃菌及链球菌数量增多则与食道癌淋巴结转移及不良预后有关[19],提示上述细菌均具有一定促癌作用。丙酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌及双歧杆菌等杆菌属则可通过诱导非特异性免疫激活途径抑制肿瘤细胞生长而发挥抗肿瘤作用[20-22]。本研究结果证实肺炎型肺癌患者下呼吸道促癌菌群无论种类及数量上均显著增高,而抑癌菌群含量下降,抑癌/促癌细菌的比例失调特征明显。促癌细菌通过多种机制参与肿瘤发生发展。已有文献证实口腔微生物菌属在口腔肿瘤、肺癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关[23],肺炎型肺癌高表达的菌属多属于口腔常见微生物菌属。其中普雷沃菌可促进细胞分泌挥发性硫化合物例如硫化氢、甲硫醇、二甲基硫醚、二甲基二硫化物等致癌物质[24],导致基因组不稳定或累积突变、并可激活增殖、迁移和侵袭性信号通路影响肿瘤的生长和扩散、抑制肿瘤细胞凋亡、增强肿瘤血管生成[25,26]。链球菌属通过TLR2受体上调IL-6表达,增加肺腺癌细胞黏附活性促进肝转移发生[27]。韦荣球菌属激活肿瘤PI3K 信号通路促进鳞癌细胞生长[28]。Tsay等[29]发现普雷沃菌、链球菌及韦荣球菌可通过激活肺癌细胞PI3K 、ERK1/2 和VEGF 信号通路,诱导IL-1β、IL-18、IL-6等炎性介质表达,并招募炎性细胞形成局部慢性炎症,促进肿瘤进展。作为口腔专性厌氧菌,普雷沃菌属、韦荣球菌、奈瑟菌属等含量增高可能与肺癌局部微环境常呈低氧状态[30],且病灶越广泛缺氧环境越明显更适宜厌氧菌生长及繁殖有关。在肿瘤的进展过程中厌氧菌的繁殖增加可促进肿瘤生长,肿瘤又为细菌生长创造出有利环境,尽管尚无法确定两者因果关系,但推测存在两者交互作用、互相影响的恶性循环。本研究选取的结节型肺癌患者为T1期局部早期患者,其下呼吸道细菌种类数量未见明显增加,但已出现了部分促癌菌属,普雷沃菌属的占比增多,细菌菌群向肺炎型肺癌促癌菌属的分布趋势漂移。结节型患者肿瘤直径大小与局部细菌序列数成正比,提示随着局部病灶的增大,细菌负荷量逐渐增加,两组存在一定相互促进作用,及时调节干预有可能能够抑制局部病灶的进展。近来提出的肿瘤微生物治疗理论认为通过上调抑癌细菌或下调促癌细菌等手段有助于调节局部微生物菌群失调,具有改善局部免疫、降低肺部炎症、提高化疗、放疗及免疫治疗疗效等作用,将日渐成为肿瘤治疗的一个重要环节[31],本研究结果为今后开展肺癌微生物治疗的方向及靶点提供了部分线索。肺炎型肺癌患者影像学上呈类似肺炎表现,临床上很容易被误诊为肺部感染而长期使用抗生素、甚至激素,而导致较长时间的误诊、漏诊,而支气管镜肺泡灌洗通常是最常见也是最重要的进行鉴别诊断的手段,BALF的实验室检查对鉴别诊断至关重要。通常肺炎型肺癌患者灌洗液中癌细胞脱落细胞阳性率不高,金标准诊断仍需要组织病理证实,但经穿刺取组织有创操作通常在支气管镜操作后且等待病理报告时间较长,临床上也存在部分患者病情重无法配合穿刺等操作而无法获取病理组织等情况,微生物NGS二代测序结果报告较快,可在获得病理结果前为临床医师提供一定提示及诊断倾向,本研究结果显示,普雷沃菌属及产黑普雷沃菌的含量增多具有较强的肺癌提示性,ROC曲线证实随着该菌属菌种数量的增加,对肺炎型肺癌诊断的特异性进一步增高,提示该菌群的高丰度表达在肺部肿瘤诊断中具有一定的潜在应用价值。但仍需要扩大样本进一步验证,临床上若发现BALF 中此类菌群明显增多的患者需要警惕肺部肿瘤的可能。由于肺炎型肺癌患者比例低,人数较少,留永健等[32]北京协和医院团队收集2013～2018年病例46例,约平均每年5例,本研究中心与之发现的病例数相似,为扩大样本量检测分析带来了一定难度,期待今后能够开展多中心研究加以解决。综上所述,本文初步研究了肺炎型肺癌患者下呼吸道微生物菌群的基本组成和种群差异,发现肺炎型肺癌患者下呼吸道微生物菌属菌种数量均较健康人复杂,其中以普雷沃菌属及产黑普雷沃细菌分布最为普遍,占明显优势,普雷沃菌属占比及产黑普雷沃细菌序列数对肺炎型肺癌诊断具有一定的预测价值。及时检查肺部弥漫性病变患者下呼吸道标本进行高通量二代测序将有助于临床鉴别诊断,并为今后深入探讨肺炎型肺癌相关发病机制及干预策略提供依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突