原发性肺黏液腺癌与非黏液性肺腺癌病例对照研究

汪海波 李鸿茹 黄艺 郑冬美 潘军帆 许能銮

福建医科大学省立临床医学院,福州 350001

肺癌已经成为全球最大杀手,根据2018年全球癌症数据库,肺癌总体发病率和病死率均居世界首位,其中肺腺癌已成为肺癌最主要的组织学亚型[1],是肺部恶性肿瘤的研究重点和热点。原发性肺黏液腺癌 (primary pulmonary mucinous adenocarcinoma,PPMA)是非小细胞肺癌 (nonsmall cell lung cancer,NSCLC)中肺腺癌的一种少见亚型,由Kish等[2]于1989年首次提出,国外报道大约占肺腺癌的0.14%[3]。PPMA 癌细胞分化程度高,恶性程度低。PPMA 早期常误诊为炎性病变、结核球和良性肿块,其中炎性病变居多。气道播散转移是其肺内转移的主要方式,不易远处转移,但也有颅脑转移[4]、睾丸转移[5]、口腔转移[6]的个案报道。因此,增加对PPMA 的认识,早期鉴别和早期诊断,对其预后改善尤为重要。本研究回顾性分析福建省立医院收治的术后PPMA患者,通过与非黏液性肺腺癌(对照组)比较,总结PPMA 的临床特征及预后情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性研究。2013年1月至2019年6月福建省立医院经术后病理确诊PPMA 共54例,男22例,女32例,男女比例为1∶1.45,年龄范围为38～76岁,平均年龄(57.0±10.0)岁。中位确诊时长2.5个月。对照组按照1∶2比例,选取同时期术后确诊为非黏液性肺腺癌患者108例。男46例,女62例,年龄范围为26～79岁,平均年龄(58.0±11.0)岁。纳入标准:经手术获取标本,病理确诊为PPMA 且随访资料完整。排除继发于消化系统或其他部位的黏液腺癌、合并活动性肺结核、伴其他严重系统疾病、确诊前已知合并其他肺部以外恶性肿瘤。采用回顾性调查方法,查阅并收集病例资料,记录患者的一般情况,如姓名、性别、年龄、个人史、肿瘤家族史、住院时长、确诊时长、临床表现、肿瘤标记物、影像表现、病理、免疫组织化学、基因突变检测以及治疗方案等。本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

1.2 治疗情况 所有患者接受手术治疗,行肺癌标准根治术 (肺叶切除+系统性淋巴结清扫)42例(77.8%),有30例手术后出现并发症,主要为肺部感染、胸腔积液、皮下气肿、气胸等。行术后化疗20例(37.0%),主要化疗方案有:卡铂/顺铂+培美曲塞15例 (27.8%)、卡铂/顺铂+紫杉醇1 例 (1.9%)、卡 铂/顺 铂+ 安 素 泰3 例(5.6%)、顺铂+吉西他滨1例 (1.9%),所有化疗方案均含铂类。行术后放疗4例,其中1例因手术后2年出现双肺及骨转移,行骨转移病灶局部放疗,放疗2个月后死于呼吸衰竭;1例为ⅢA 期化疗后联合放疗,截至随访时间未见肿瘤复发;1例为Ⅱ期化疗后联合放疗,放疗期间出现3度骨髓抑制而终止放疗,2年后肿瘤局部复发;1例因手术后4年出现脑转移,予颅脑姑息放疗,放疗半年后脑转移灶消失,截至随访时间患者没有出现肿瘤复发。表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变检测 (组织PCR 法)阳性率为10.5% (4/38),突变位点均为21号外显子L858R 突变,2 例口服 “吉非替尼 (易瑞沙)250 mg,1次/d”治疗,其中1例因手术后2年发现纵隔淋巴结转移,开始口服易瑞沙,截至随访时间患者病情评估为疾病稳定 (stable disease,SD);另1例因手术后2年出现双肺及骨转移,开始口服易瑞沙治疗,靶向治疗2个月后死于呼吸衰竭。动物微管相关蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因检测(组织PCR 法)阳性率20.0% (3/15),其中1例因分期晚,于手术后即开始口服“克唑替尼250 mg,2 次/d”,靶向治疗1 年后出现耐药,开始规律予含吉西他滨方案化疗,截至随访时间患者没有出现肿瘤进展;其他2例至今未复发,未服用相关靶向药物。

1.3 研究方法

1.3.1 病理检查 切除组织标本均经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,切片厚度4μm,HE 染色,光镜观察。PPMA 包括肺原位黏液型腺癌、肺微浸润黏液型腺癌、肺浸润性黏液腺癌(pulmonary invasive mucinous adenocarcinoma,PIMA)、实体为主伴黏液分泌型腺癌及胶样癌。其中PIMA 根据黏液成分与非黏液成分所占比分为单纯型与混合型。单纯型肺浸润性黏液腺癌定义为肿瘤细胞呈鳞屑样生长,其黏液成分>90%的浸润性黏液腺癌。肺浸润性黏液/非黏液混合型腺癌定义为肺浸润性黏液腺癌中混有贴壁生长型、腺泡型、乳头型和微乳头型等非黏液腺癌成分,且非黏液腺癌成分≥10%非黏液成分的组织类型[7]。54例PPMA 患者中单纯PIMA 患者26 例,混合型PIMA 患者26例,胶样癌2例,因胶样癌样本量少不纳入本研究。

1.3.2 免疫组织化学 免疫组织化学染色采用En Vision两步法,具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行,每张切片均设阳、阴性对照。一抗、二抗和SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。结果判定采用组织学评分法评估,按照各自染色程度和染色细胞数进行综合量化分析评分。

1.4 随访 随访从手术治疗第1天开始计算,所有患者均随访截止2019 年8 月16 日。全组随访162例,随访2～77 个月,中位随访期17 个月,没有失访。复发定义为从手术治疗后原手术部位再次出现病灶或在其他部位形成与原发部位肿瘤相同类型的肿瘤。复发时间定义为从手术时间至第1次确定复发病灶的时间。无病生存期 (disease-free survival,DFS)定义为从手术时间至术后第1 次随访出现复发证据的时间。总生存期 (overall survival,OS)定义为从手术时间至死亡的时间或随访结束时间。

1.5 统计学方法 采用统计软件SPSS 23.0进行分析,定量资料若为正态分布,用±s表示,组间比较采用t检验;非正态分布资料用中位数和四分位数[M(P25,P75)]表示,组间比较使用非参数检验Mann-WhitneyU检验。等级资料采用Wilcoxon秩和检验;计数资料采用例 (%)表示,组间比较采用χ2检验。将单因素分析中P<0.05的相关因素应用二元Logistic 回归分析,根据Logistic回归分析的结果参数建立PPMA 预测模型公式,并对PPMA 预测模型的预测能力使用ROC 曲线分析评价。 生存分析采用绘制Kaplan-Meier生存时间曲线,以Log-Rank检验为标准。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料 2组年龄、性别、手术方式、病理类型及TNM 分期基线资料差异均无统计学意义(P值均>0.05),具有可比性。见表1。

表1 2组患者基线资料比较

2.2 临床特征比较 PPMA 组患者中位数确诊时长较长(2.5个月),咳黏液痰发生率高 (16.7%,9/54),血清胃泌素释放肽前体 (prosoma gastric secretin release peptide,Pro-GRP)异常率高(40.7%,22/54)。PPMA 患者肿瘤好发于双肺下叶(50.0%,27/54),CT 表现为肺炎型发生率低(14.8%,8/54),支气管充气征、空泡征发生率高(37.0% 和18.5%,20/54 和10/54)。 再 者,PPMA 患者更容易出现被膜侵犯59.2% (32/54)、淋巴结转移35.2% (19/54),EGFR 基因突变率11.1% (6/54)明显较低。见表2。

2.3 免疫组织化学检查比较 部分患者做了免疫组织化学检测,PPMA 组TTF-1、Napsin A 阳性表达均明显低于对照组 (P<0.01),见表3。PPMA 组Ki67表达情况与对照组比较差异无统计学意义,但亚组分析显示与对照组比较,单纯型PIMA 组及混合型PIMA 组Ki67阳性表达差异均有统计学意义(χ2=6.573,P=0.019)。见表4。

表2 2组患者临床特征比较

表3 2组免疫组织化学结果比较 [例 (%)]

表4 PIMA 患者组织学亚型与对照组之间Ki67比较 [例 (%)]

2.4 PPMA 多因素分析及ROC 曲线分析 以确诊时长、咳黏液痰、血清Pro-GRP、肿瘤位置、肿瘤形态、支气管充气征、空泡征、淋巴结转移、被膜侵犯、TTF-1、Napsin A、EGFR 基因突变为自变量行多因素Logistic回归分析。其中有咳黏液痰、血清Pro-GRP 异常、肿瘤位于双肺下叶、肿瘤形态为结节肿块型、有支气管充气征、有空泡征、有淋巴结转移、有被膜侵犯、TTF-1 和Napsin A 阳性表达、EGFR 基因突变阳性定义为1。结果显示咳黏液痰 (P=0.011)、CT 表现空泡征 (P=0.027)、被 膜 侵 犯 (P=0.004)、Napsin A (P=0.018)、EGFR 基因突变 (P<0.001)。其危险度分别为10.080 (1.688-60.199)、5.156 (1.206-22.044)、5.004 (1.669-15.003)、0.186 (0.046-0.750)、0.054 (0.013-0.231)。确诊时长、血清Pro-GRP、肿瘤位于双肺下叶、肿瘤形态、支气管充气征、淋巴结转移、TTF-1 差异无统计学意义。见表5。

根据Logistic回归分析,得出腺癌患者诊断为PPMA 预测模型公式:Logit(P)=2.311×咳黏液痰+1.640×空泡征+1.610×被膜侵犯-1.683×Napsin A-2.912×EGFR 基因突变。通过此模型得到每例腺癌患者诊断为PPMA 的预测概率,并利用ROC曲线评价该模型的预测能力 (图1)。分析ROC曲线,显示ROC 曲线下面积0.905,根据ROC曲线诊断标准,该模型的诊断准确性为较高。根据约登指数,当截断界点为0.395时,其敏感度和特异度最大,分别为81.48%、86.11%。

表5 原发性肺黏液腺癌的多因素Logistic回归分析结果

图1 PPMA 预报能力的ROC曲线

2.5 预后比较 本研究PPMA 组有10 例(18.5%)复发,复发中位时间16个月,与对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。生存分析结果显示,PPMA 患者5 年无病生存率为74.3%,1、3、5 年 生 存 率 分 别 为96.3%、92.8%、92.8%,与对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。亚组分析显示单纯型PIMA 患者5年无病生存率高于对照组与混合型PIMA 组。见表6、7,图2。

图2 PPMA 不同组织亚型与非黏液性肺腺癌患者DFS比较

表6 两组预后比较

表7 PIMA 患者组织学亚型与对照组之间预后比较

3 讨论

PPMA 临床少见,早期预后较好,但由于临床特征认识不足导致治疗延误、淋巴结转移率高、EGFR 基因突变率低[8]等原因,导致一部分晚期PPMA 患者预后并不好[3]。因此,本研究以了解PPMA 临床特征,并建立PPMA 的预测模型,促进对PPMA 的理解。

相比于非黏液性肺腺癌,本研究中54 例PPMA 患者从发现肺部影像异常或有临床症状到确诊的时间更长,考虑PPMA 相当一部分患者无明显临床症状,患者较晚就诊所致。本研究咳黏液性痰可能是PPMA 的特异性表现。Popat等[9]研究表明由于PPMA 由含黏液的杯状细胞及柱状细胞组成,胞浆富含黏液,其癌细胞可以分泌大量黏液而致使肺泡内黏液明显增多,因此可表现为长期反复咳白色泡沫样黏液痰,此症状可以是其唯一的表现。也有学者认为当咳痰量>100 ml/24 h,就应考虑是否为肺黏液性腺癌的可能[10]。

Pro-GRP是一种神经内分泌源肿瘤标志物,Taira等[11]发现在NSCLC 患者伴神经内分泌特征时血清Pro-GRP 水平可以升高。本研究显示PPMA 组患者Pro-GRP 升高率明显高于非黏液性肺腺癌患者。陈国勤等[12]研究显示其纳入研究肺黏液腺癌患者嗜铬粒素A (chromogranin A,Cg A)和突触素 (synaptophysin,Syn)的阳性率分别为100%和71.4%,且阳性率均高于同组其他类型的腺癌。而Cg A 和Syn是神经性内分泌肿瘤的特异性标志物,为判断肿瘤神经内分泌化可靠的指标[13]。因此,认为PPMA 患者血清Pro-GRP异常可能与PPMA 肿瘤细胞发生神经内分泌化有关。

本研究显示PPMA 患者胸部CT 表现有一定特异性,主要表现为肿瘤好发于双肺下叶,肿瘤形态以结节肿块型多见,可见支气管充气征及空泡征。目前认为PPMA 更易发生于双肺下叶,其原因可能与PPMA 起源于杯状细胞有关。Sawada等[14]认为杯状细胞分泌的黏蛋白用于支气管黏膜纤毛的清除异物作用,因为长期吸烟或吸入空气异物等刺激引起的细胞的增生与化生导致PPMA。当人在直立或睡觉时由于重力作用,双肺下叶清除异物的作用比其他各肺叶更明显,杯状细胞更容易接受外界刺激从而增生与化生,因此PPMA 相比于其他类型腺癌更易发生于双肺下叶。本研究认为支气管充气征可能是PPMA 的特征性表现。Oda等[15]认为由于PPMA 起源于杯状细胞,肿瘤细胞生长迅速时,黏液分泌旺盛,导致黏液过量并聚集在肺泡及其周围细小支气管中,从而阻塞气道,因此PPMA 相比非黏液肺腺癌更易出现支气管充气征。由于PPMA 肿瘤细胞沿肺泡壁、细支气管生长,容易挤压支气管壁,所以PPMA 患者空气支气管征官腔多狭窄不规则、管壁不光滑,借此可与肺炎性实变鉴别[16]。本研究显示PPMA 患者空泡征常见。Miyata等[17]认为PPMA 肿瘤细胞沿支气管管壁浸润性生长,易使管腔形成活瓣效应,由于气体进入肺泡腔容易而排出困难,导致肺泡腔过度充气形成空泡征,因此PPMA 患者空泡征常见。

本研究结果显示PPMA 患者EGFR 基因突变阳性4例 (7.4%),全部为21号外显子L858R突变,阳性率明显低于对照组,与Hata等[8]报道相符。EGFR 基因突变阳性患者可以受益于靶向药物治疗,但容易出现耐药。本研究PPMA 组有2例EGFR 基因突变阳性患者接受吉非替尼治疗,1例治疗2个月后疾病进展而死亡,考虑靶向药物耐药有关。Kobayashi等[18]认为耐药的机制可能与瘤组织EGFR 基因发生了第二次突变有关,其突变的位点在第20号外显子,即酪氨酸激酶活化域的790位苏氨酸残基被蛋氨酸替代,从而影响了EGFR-TKI预期靶点的结合。因此,可以发现PPMA 患者EGFR 突变率低,且对靶向药物治疗效果差。

黏液腺癌常见于胃肠道肿瘤,可转移至肺部,因此在诊断PPMA 时应排除胃肠道肿瘤。Rossi等[3]研究显示PPMA 与肺源性标志物TTF-1、CK7反应呈阳性,而消化道标志物CDX2、MUC2和CK20反应呈阴性,由此可鉴别PPMA 的原发部位。本研究结果显示PPMA 患者TTF-1 和Napsin A 表达均明显低于对照组,而两组CK7表达差异无统计学意义。Lau等[19]认为Napsin A 主要表达于Ⅱ型肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞,TTF-1由甲状腺滤泡和滤泡旁c细胞、Ⅱ型肺细胞和肺的非纤毛细支气管上皮 (clara细胞)选择性表达,肺腺癌中含有黏液部分主要为杯状细胞或产生粘蛋白的细胞,无黏液部分主要是Ⅱ型肺细胞或clara细胞分化,而TTF-1、Napsin A 在黏液成分中表达缺失。因此,含有黏液成分的PPMA 的TTF-1与Napsin A 阳性表达率低于非黏液腺癌,而CK7 在黏液成分中亦可表达,故CK7 表达在PPMA 与非黏液性腺癌之间差异无统计学意义。本研究显示PPMA 组Ki67表达情况与对照组比较差异无统计学意义,但亚组分析显示与对照组比较,单纯型PIMA 组及混合型PIMA 组Ki67阳性表达差异均有统计学意义。Ki67是反应肿瘤细胞增殖标记物,表达于增殖细胞中,可以直接与反应肿瘤增殖的核抗原发生反应,在不同肿瘤类型中表达有差异。因此,提示黏液为主的肿瘤细胞增殖活性可能低于非黏液性肿瘤细胞。

本研究通过Logistic回归分析建立PPMA 预测模型公式,发现肺腺癌患者如有咳黏液痰、胸部CT 可见空泡征、病理证实被膜侵犯、免疫组织化学Napsin A 低表达以及EGFR 基因突变阴性应高度怀疑PPMA。该模型有较高的灵敏度和特异度,因此可以有效协助PPMA 的早期发现,避免了误诊和漏诊,达到早期治疗PPMA,提高患者预后。

本研究结果显示PPMA 组复发率为18.5%,中位复发时间为16个月,与对照组相比差异无统计学意义。目前认为PPMA 肿瘤复发考虑与肿瘤细胞通过气道播散 (tumor spread through airspaces,STAS)有关[20],STAS是一种新的侵袭模式,当STAS 存在于肺段切除的肺叶中时,局部复发和远处转移率均显著增加,因此预后不良。Warth等[21]研究显示即使在体积较小的早期PIMA 中也可能发生STAS。Hwang等[22]研究证实术后复发与肿瘤内非黏液性浸润结构的范围、是否存在胸膜和血管侵犯有关。

本研究结果显示PPMA 组与对照组总体预后差异无统计学意义,与Cai等[23]研究相符,但与Lee等[24]研究有所差异,考虑纳入样本人群的差异有关。本研究进一步亚组分析显示单纯型PIMA组预后好于对照组与混合型PIMA 组,这与Ki67表达情况一致。Ki67参与肿瘤增殖调控,与肿瘤分化程度、TNM 分期相关,可用于判断肿瘤侵袭力,是预后不良的指标。Luo等[25]认为由于纯黏液腺癌的组织学特征是细胞内黏液丰富的杯状细胞和柱状细胞的鳞状生长,侵袭力低于非黏液生长模式中微乳头等成分,因此单纯型总体预后较好。

总之,本研究分析发现PPMA 有一定的临床特征,并建立有效的预测模型,帮助早期识别、诊断PPMA,对临床有一定的指导意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突