西瓦克颗粒指纹图谱及抗氧化活性研究

陈 丽 刘 柳 马庆苓 希尔艾力·吐尔逊 吴 涛 信学雷 阿吉艾克拜尔·艾萨

1.中国科学院新疆理化技术研究所干旱区植物资源化学重点实验室，新疆乌鲁木齐 830011；2.中国科学院大学研究生院，北京 100049；3.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所维吾尔医方剂学重点实验室，新疆乌鲁木齐 830049

西瓦克方剂由一枝蒿、茵陈、毛菊苣、玫瑰花、大黄和甘草六味药材组成，传统采取全方水提制成口服制剂，在新疆维吾尔自治区维吾尔医院主要用于治疗肝损伤，具有显著的保肝护肝功效，但其质控方面尚未完善。中药指纹图谱能够全面反映复方所含的复杂化学成分，且已在中药质量控制研究中得到了广泛的应用，是评价药品质量非常重要的手段之一[1-9]。本课题组前期已对西瓦克颗粒物质作用基础及小鼠肝损伤保肝作用进行了初步的研究[10]，本实验建立了西瓦克颗粒指纹图谱及含量测定方法[11-21]，并测定了10 批西瓦克颗粒中5 个成分的含量。同时采用薄层色谱-生物自显影的方法对西瓦克颗粒体外抗氧化活性进行了评价。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 高效液相色谱仪（美国）；Sartorius BT 25S型十万分之一电子天平（赛多利斯）；SK7210LHC 型超声清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；高效薄层色谱仪（HPLC，瑞士CAMAG）；薄层色谱扫描仪（瑞士CAMAG，型号：TLC Scanner3 System）。

1.2 药品与试剂

10 批次西瓦克颗粒（自制），批号分别为S1：20161206，S2：20161208，S3：20170105，S4：20161213，S5：20170109，S6：20161216，S7：20161219，S8：20161220，S9：20161222，S10：20170112。一枝蒿酮酸（中国科学院新疆理化技术研究所提供，批号：GSB11-2530-2016）；没食子酸（批号：110831-201604）、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸（批号：111782-201706）、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸（批号：111894-201602）、异槲皮苷（批号：111809-201403）对照品均由中国食品药品检定研究院提供。

1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）（德国慕尼黑），2，2’-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）（Sigma），甲醇、乙腈均为色谱纯，重蒸水（自制）。高效薄层色谱正相硅胶玻璃板GF254（20 cm×10 cm，Merck，Darmstadt，德国）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

InertSustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱0～10 min，4%～7%A；10～30 min，7%～8%A；30～35 min，8%～10%A；35～65 min，10%～13%A；65～80 min，13%～16%A；80～100 min，16%～28%A。检测波长：0～＜39 min：320 nm，39～＜63 min：300 nm，63～＜67 min：360 nm，67.0～＜70.5 min：350 nm，70.5～＜73.5 min：245 nm，73.5～＜100.0 min：260 nm，流速1.0 mL/min；柱温30℃，进样量10 μL，理论塔板数按各色谱峰计算应不低于5000。

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取5 个特征化合物对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇溶液分别制成每1 mL 含没食子酸86.10 μg、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸9.25 μg、异槲皮苷20.21 μg、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸12.08 μg、一枝蒿酮酸25.67 μg 的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取西瓦克颗粒约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，取出，冷却至室温，再称定重量，用相应溶剂补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 西瓦克颗粒指纹图谱的建立

将10 批西瓦克颗粒HPLC 图谱导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）”进行分析，以S1 为参照图谱，时间窗为0.1 min，采用多点校正后，自动进行色谱峰匹配，以中位数法生成指纹图谱（图1）。经处理后共标定36 个共有峰，通过与对照品的比较对照，指认了其中5 个特征峰，分别是没食子酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、一枝蒿酮酸（图2）。结果表明，10 批西瓦克颗粒色谱图相似度均≥0.811（表1）。表明制备工艺稳定，方法准确可靠。

表1 10 批西瓦克颗粒相似度

图1 10 批西瓦克颗粒指纹图谱

图2 混合对照品与西瓦克颗粒高效液相色谱分析图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性范围考察 精密量取“2.2”项下混合对照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样，以没食子酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、异槲皮苷、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、一枝蒿酮酸的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，各成分回归方程见表2。

表2 西瓦克颗粒中5 种化合物回归方程与线性范围

2.5.2 精密度实验 取适量浓度的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6 次，测得没食子酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、异槲皮苷、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、一枝蒿酮酸的峰面积相对标准差（RSD）分别为0.85%、0.59%、2.09%、1.39%、0.47%，均＜3%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一供试品（S4，批号：20161213），按“2.3”项下方法，制备供试品溶液。于制备后0、2、4、6、8、10、12 h 分别进样，按“2.1”项下色谱条件测定，测得没食子酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、异槲皮苷、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、一枝蒿酮酸峰面积的RSD分别为0.52%、0.76%、2.02%、2.20%、0.43%，均＜3%，表明供试品溶液放置12 h 稳定。

2.5.4 重复性实验 取同一供试品（S4，批号为20161213），按“2.3”项下的方法，制备6 份供试品溶液，按2.1 项下测定，测得没食子酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、异槲皮苷、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、一枝蒿酮酸峰含量的RSD 分别为1.24%、2.43%、2.07%、2.42%、2.18%，均＜3%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率 取已知含量的供试品0.350 g（其中没食子酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、异槲皮苷、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、一枝蒿酮酸的含量分别为1.59、0.21、0.28、0.20、0.43 mg/g），精密称定，共9 份于10 mL容量瓶中，按照供试品中5 个化合物的含量与各自对照品溶液1∶1 的量分别加入混合对照品，加入50%甲醇适量，超声处理（250 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，定容至刻度，按上述方法测定5 个化合物的加样回收率。见表3～7。

表3 没食子酸回收率

表4 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸回收率

表5 异槲皮苷回收率

表6 4，5-O-二咖啡酰奎宁酸回收率

表7 一枝蒿酮酸回收率

2.6 10 批西瓦克颗粒5 个特征成分的含量测定

取10 批西瓦克颗粒，照“2.3”项下方法，依法制备，按上述拟定的含测方法测定5 个化合物含量，平行操作2 次，取平均值，结果见表8。

表8 10 批西瓦克颗粒中5 个特征化合物的含量（mg/g）

2.7 薄层色谱指纹图谱

分别取10 批西瓦克颗粒1.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。取秦皮乙素，同法制成每1 mL 含0.2 mg 的对照品溶液。以乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水（12∶1∶1∶1）为展开剂，展开后置紫外灯下检视。通过对薄层板斑点位置、颜色的比对，表明供试品质量均一、稳定，由此建立了供试品薄层色谱指纹图谱的方法。见图3（封三）。

图3 西瓦克颗粒和秦皮乙素薄层色谱图

2.8 薄层生物自显影法检测西瓦克颗粒体外抗氧化活性

薄层生物自显影法可以准确、快速、直观地判断中药复方制剂清除自由基的能力[22-24]。当ABTS 和DPPH 与抗氧化活性成分结合后，会形成白色和黄色斑点[25-26]。供试品与自由基反应后，色谱条带多数部位分别呈现出白色和亮黄色，说明西瓦克颗粒含有具备清除自由基的成分，具备一定抗氧化活性。见图4（封三）。

图4 西瓦克颗粒和秦皮乙素薄层色谱图

3 讨论

本实验采用50%甲醇制备供试品溶液，以0.2%磷酸：乙腈系统为流动相，并根据HPLC 色谱图中不同类型化合物的保留时间及吸收波长的特点，采用分时段波长检测，同时测定黄酮、多酚和倍半萜等不同类型的化合物。

由本实验结果可知，10 批西瓦克颗粒指纹图谱相似度均≥0.811，提示西瓦克颗粒制备工艺稳定性、重现性良好，可批量生产。通过与对照品比对，指认了5 个特征化合物，分别为没食子酸、3，5-O-二咖啡酰奎宁酸、异槲皮苷、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、一枝蒿酮酸。并能在同一色谱条件下，同时测定10 批西瓦克颗粒中5 个特征化合物的含量，为其质量控制提供依据。

通过西瓦克颗粒与ABTS、DPPH 的反应表明其具有良好的清除自由基和抗氧化活性的作用[27-28]。

综上所述，本研究所建立的指纹图谱可用于西瓦克颗粒的质量评价，含量测定方法操作简便，可同时测定5 种特征成分的含量，与抗氧化活性相关的有效成分及其保肝作用机制有待于进一步的探索和研究。