基于网络药理学和分子对接技术探讨参附汤治疗心肌梗死的活性成分及靶点

刘甜甜 姚魁武

1.中国中医科学院广安门医院心血管科，北京 100053；2.北京中医药大学东方医院药剂科，北京 100078

心肌梗死是临床常见疾病，近年来发病率逐年升 高，并趋于年轻化。现代治疗心肌梗死的方法除药物治疗、介入治疗、心脏辅助装置和心脏移植外，中医药疗法因在预防介入术后再狭窄、防治再灌注后无复流、改善患者临床症状、提高生活质量、增加活动耐量和改善患者远期预后等优势，已逐渐成为临床治疗心肌梗死的重要手段。中医认为心肌梗死属“胸痹”“心痛”“心悸”等病证范畴，指出心肌梗死的基本病机是阳微阴弦、心阳不振、瘀血滞脉。参附汤源自《圣济总录》卷五十九，该方主要由人参、附子组成，具有回阳益气、救脱之功效。临床常用其单方或合方防治心力衰竭，心绞痛和阿霉素导致的心脏毒性等[1-5]。关于参附汤治疗心肌梗死的作用机制还未见报道，本研究旨在应用网络药理学及分子对接构建参附汤治疗心肌梗死的“药物-活性成分-靶点-通路”关联网络和关键成分-核心靶点的结合位点，从中医整体观探索参附汤治疗心肌梗死的作用机制。

1 资料与方法

1.1 筛选参附汤活性成分及靶点

采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）依次搜索参附汤中人参、附子的活性成分，设置筛选参数为口服生物利用度（OB）＞30%且类药性（DL）＞0.18，选出参附汤活性成分[6]。采用TCMSP 数据库获得人参、附子活性成分的靶点蛋白，采用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）和String 平 台（https：//string-db.org/cgi/input.pl）将蛋白名转为基因名。

1.2 绘制“活性成分-靶点”网络

采用Cytoscape 3.7.2 软件绘制“活性成分-靶点”网络图，使用网络拓扑结构分析，计算出自由度（degree），挑选主要活性成分[7]。

1.3 筛选心肌梗死靶点

GeneCards 是人类基因信息收录最全面的数据库，在GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org）中输入关键词“myocardial infarction”，检索心肌梗死靶基因[8]。

1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络

取活性成分和疾病的相交靶点基因，录入String数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl），物种设为“Homo sapiens”，获取基因-基因相互作用网络数据[9]，将数据以TSV.格式导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建PPI 网络，基于网络拓扑参数获得degree 值较高的核心靶点。

1.5 分析靶点基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路

应用David 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp）进行相交靶基因的生物过程、分子功能和KEGG通路富集分析[10]。依据P ＜0.05 和错误发现率Benjamini ＜0.05，选出差异显著的生物过程和信号通路。采用Cytoscape 软件绘制“药物-活性成分-关键靶点-信号通路”网络。

1.6 分子对接

将“活性成分-靶点”网络中degree 值最高的4 个活性成分与PPI 网络中degree 值最高的7个核心蛋白进行分子对接。通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获得活性成分3D 结构，通过PDB 数据库（http：//www.rcsb.org）获取蛋白质结构。使用DockThor 平台（https：//dockthor.lncc.br/v2/）进行预处理和分子对接[11]，通过Pymol 软件进行对接结果可视化。

2 结果

2.1 参附汤的活性成分和靶点

通过TCMSP 数据库检索到人参活性成分22 个，附子活性成分21 个，删除重复项之后的作用靶点120 个。其中，17 个人参活性成分和6 个附子活性成分具有作用靶点。

2.2 活性成分-靶点网络

通过Cytoscape 软件构建“活性成分-靶点”网络，网络拓扑分析得出142 个节点，286 条边，平均degree值为4，图中degree 值越大，颜色越深，见图1。degree大于均值的化合物有13 个，见表1。

表1 degree 值较大的活性成分

图1 活性成分-靶点网络

2.3 参附汤活性成分治疗心肌梗死的靶点

以心肌梗死为关键词，在GeneCards 数据库搜索疾病靶点，共检索到3651 个靶点，依据相关性得分≥1，得到心肌梗死靶基因2495 个。对活性成分和疾病靶点取交集，获得78 个相交靶点，见图2。

图2 化合物-疾病韦恩图

2.4 参附汤治疗心肌梗死的靶点PPI 网络分析

将78 个相交靶点，录入String 数据库，获得PPI网络及互作数据，将数据导入Cytoscape 软件进行拓扑参数分析，得到69 个节点，280 条边，平均介数为0.039 79，平均接近中心性为0.406，平均最短路径长度为2.633，平均degree 值为8，其中degree 值≥9 的靶点有AKT1、MAPK8、TNF、JUN、STAT3、IL-1β、RELA、PTGS2、STAT1、HSP90AA1、CASP3、PPARG、CASP8、NOS2、ICAM1、IFNG、RXRA、NR3C1、NFKBIA、AR、ESR1、HMOX1、BCL2、VCAM1、TGFB1、PRKCA。对上述26 个靶点进行子网络提取，获得核心靶点的PPI 网络，圈越大表示degree 值越大，说明参与的生物功能越多，在网络中的重要性越强，见图3。

图3 参附汤治疗心肌梗死的靶点PPI 网络图

2.5 参附汤治疗心肌梗死的靶点功能和通路富集分析

把78 个靶点导入David 数据库，根据P ＜0.05和错误发现率Benjamini＜0.05，选出102 个生物过程、26 个分子功能、15 个细胞组分。生物过程主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、信号转导、细胞增殖的正调控、凋亡过程、缺氧反应、炎症反应等。分子功能涉及蛋白质结合、蛋白质同源二聚活性、酶结合、转录因子活性、蛋白质异构化活性、转录因子结合等。细胞组分涉及质膜、胞浆、细胞外间隙、核染色质等。选出基因条目数排名前12 的生物过程、分子功能、细胞组分绘制条形图，见图4。

图4 参附汤治疗心肌梗死的靶点GO 功能分析

采用David 数据库对78 个靶点进行KEGG 通路富集分析，得到102 个条目，依据P ＜0.05 和错误发现率Benjamini＜0.05，去掉共性通路后，得到差异显著的22 个信号通路，见表2。使用Cytoscape 软件绘制“药物-活性成分-关键靶点-信号通路”网络，见图5，方形表示药物，菱形表示活性成分，圆形表示关键靶点，角形表示信号通路，结果显示参附汤主要通过2 味中药的22 个活性成分，作用于78 个靶点的22 条信号通路治疗心肌梗死。

图5 药物-活性成分-关键靶点-信号通路网络

表2 参附汤治疗心肌梗死的靶点通路

2.6 参附汤治疗心肌梗死的活性成分分子对接结果

采用DockThor 软件将“活性成分-靶点”网络degree 较高的4 个活性成分与PPI 网络中degree 较高的7 个核心蛋白进行分子对接，对接结合能见表3。将结果导入Pymol 软件进行可视化，得到分子对接三维图。分子对接结果显示，山奈酚与AKT1 中氨基酸残基ASP240、ASP258 形成氢键，与TNF 中残基LEU90、ILE89、PRO88、GLU141、ASP139 形成氢键，与MAPK8 中残基ASP161、GLU101、MET103 形成氢键；β-谷甾醇与AKT1 中残基ALA54 形成氢键，与TNF中残基ASN21 形成氢键，与MAPK8 中残基MET103形成氢键；豆甾醇与AKT1 中残基ALA54 形成氢键，与TNF 中残基SER43、LYS42 形成氢键，与MAPK8中残基MET103、GLU101 形成氢键，见图6。

图6 部分蛋白和活性成分的分子对接结果

表3 关键活性成分与核心蛋白结合能（kcal/mol）

3 讨论

参附汤主要由人参、附子组成，该方药少而力专，人参大补元气、复脉固脱，附子回阳救逆、散寒止痛。全方合奏益气、温阳、固脱、止痛之功。药理研究证实，参附汤具有抗氧化应激、增加冠脉血流、改善血液流变学、保护心功能的作用，临床常用于心肌梗死、心肌重塑、慢性心力衰竭、心律失常等治疗[12-16]。目前发现参附汤可能还有防治新型冠状病毒肺炎的功效[17-18]。本研究结果显示，参附汤的活性成分山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、弗罗汀酮、人参皂苷等可能主要作用于核心靶点上的炎症免疫、细胞凋亡、血管新生、氧化应激等介导心肌梗死的治疗。

通过网络药理学对参附汤治疗心肌梗死的作用机制进行系统研究，发现人参、附子有22 个生物活性成分，其中degree 值较大的山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、弗罗汀酮、人参皂苷rh2、吉九里香碱、阿朴天仙子碱等可能是参附汤发挥疗效的基础。研究证实，人参中黄酮醇类化合物、人参皂苷具有保护血管内皮、提高免疫功能、改善心肌缺血、抑制细胞凋亡的作用[19-22]。附子中生物碱类物质具有强心、降压、抗炎、镇痛、抗血栓、保护心肌等功效[23-25]。据此推测参附汤可能基于上述成分发挥治疗作用。

GO 功能分析显示，参附汤主要通过调控细胞增殖、凋亡过程、一氧化氮生物合成、缺氧和炎症反应等方面参与心肌梗死治疗。KEGG 通路富集分析表明，TNF、NF-κB、MAPK、mTOR、PI3K-Akt、VEGF、细胞凋亡等信号通路是参附汤治疗心肌梗死的主要作用机制，并且参附汤通过以上通路发挥抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡和促进血管新生作用。分子对接结果显示，参附汤中的主要活性成分山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、弗罗汀酮A 与核心靶点AKT1、TNF、MAPK8、STAT3、JUN、IL-1β、RELA 表现出较好的结合能力，说明活性化合物与核心靶点存在相互作用，且可以形成结合能低、活性高、结构稳定的构象[26]。综上说明参附汤可能通过与核心靶蛋白互作，激活或阻断多条信号通路发挥减轻炎症反应、抑制心肌凋亡、促进血管再生的作用。

本研究采用网络药理学和分子对接方法探讨参附汤的活性成分及作用靶点，结果显示，参附汤中黄酮醇类和生物碱类化合物通过作用于78 个核心靶点上的22 条通路协同抗心肌梗死。由于中药复方存在多成分、多靶点及有效成分与靶点相互作用不清等问题。因此，后续还要通过临床和基础实验进一步验证，深入探索参附汤治疗心肌梗死的作用机制。