大鼠急性胰腺炎外分泌细胞自噬中miR-148a的作用研究

陈希妍 张建新 孔令宇 牛丽丹 李广鹏 朱秀英 石金河

新乡医学院第一附属医院急诊科(卫辉 453100)

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床常见的胰腺无菌性炎症，由于其发病机制并不明确，对其有效的治疗方式也较为缺乏，可导致全身炎症反应综合征或多器官衰竭[1- 2]。微小RNA(microRNA, miRNA)是长度约为20- 22核苷酸的非编码RNA，其具有调控靶基因表达的作用，在疾病的发生发展中起到重要作用。研究显示上调miR- 383的表达可抑制AP病程中胰腺腺泡细胞的自噬功能[3]。miR-148a可通过Hedgehog信号通路调节肝星状细胞的自噬[4]，并且死亡患者血清miR-148a相对表达量低于生存患者，提示miR-148a可能与急性胰腺炎患者的预后存在联系[5]。而miR-148a是否可通过调节AP过程中腺泡细胞的自噬而调节炎性因子的释放及腺泡细胞的活性还鲜见报道。本研究以AR42J细胞为研究对象, 利用AP模型，检测miR-148a对AP过程中细胞自噬的影响，为临床AP的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞

大鼠AR42J细胞购自于美国ATCC细胞库，本研究获本院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

胎牛血清、RPMI1640培养液购自于美国Gibco公司。牛磺胆酸钠盐(TLCs)购自于美国Sigma公司。miR-148a mimics、阴性对照miR-148a、Lipofectamine 2000转染试剂购自于苏州吉玛基因公司。逆转录试剂盒购自于北京全式金生物技术有限公司。Beclin1抗体购自于美国SANTA Cruz公司，LC3抗体购自于美国CST公司，GAPDH抗体购自于美国Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠胰腺AR42J细胞的培养 AR42J细胞培养于的RPMI1640培养液中(含20%胎牛血清，含100 U/mL 青霉素及0.1 mg /mL链霉素)，于37 ℃、5% CO2的无菌恒温培养箱中，2～3 d传代1次，选取对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 细胞转染及细胞分组 按照Lipofectamine 2000转染试剂的使用说明，利用Lipofectamine 2000将 miR-148a mimics与阴性对照miR-148a转染至AR42J细胞中。细胞分为正常对照组(正常培养48 h，normal control group)、模型组(正常培养48 h后TLCs刺激20 min, model group)、阴性对照miR-148a组(转染阴性对照miR-148a 48 h后，TLCs刺激20 min，miR-148a negative control group)，miR-148a mimics组(转染miR-148a mimics 48 h后，TLCs刺激20 min，miR-148a mimics group)。

1.3.3 利用RT-qPCR检测各组细胞中miR-148a mRNA的表达 取对数生长期的AR42J细胞接种于6孔板中，按照上述方法分为4组，在TLCs刺激20 min后分别提取各组细胞的总RNA，检测RNA浓度与纯度后，利用RT-qPCR检测各组细胞中miR-148a mRNA的表达变化，(miR-148a Forward: 5′-ATGCTCAGTGCACTACAGAA- 3′; miR-148a Reverse: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′)，所有步骤均按照试剂盒及仪器的操作说明进行。

1.3.4 利用CCK- 8实验检测各组细胞活性 取对数生长期的AR42J细胞接种于96孔板中，接种密度为5×103个/孔，将细胞分为上述4组，在TLCs刺激20 min后检测各组细胞活性，每孔加入10 μL CCK- 8溶液，正常培养条件下继续孵育2 h，酶标仪450 nm处测OD值。

1.3.5 利用ELISA检测各组细胞培养液中炎性因子IL- 6，IL-1β，TNF-α的水平 取对数生长期的AR42J细胞接种于6孔板中，按照上述方法分为4组，在TLCs刺激20 min后分别收集各组细胞的培养液，按照试剂盒说明书检测各组细胞培养液中IL- 6，IL-1β及TNF-α的含量，使用酶标仪检测吸光度值(450 nm)，计算各组细胞培养液中细胞因子的含量(pg/mL)。

1.3.6 利用Western blot检测细胞中Beclin1，LC3蛋白的表达变化 取对数生长期的AR42J细胞接种于6孔板中，按照上述方法分为4组，在TLCs刺激20 min后分别提取各组细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳，转膜，室温封闭膜1 h，4 ℃孵育一抗过夜，抗体浓度分别是Beclin1抗体(1:500)，LC3抗体(1:1 000)及GAPDH抗体(1:10 000)，荧光II抗(1:1 000)孵育，曝光，利用Image J软件分析灰度值。

2 结 果

2.1 各组细胞中miR-148a mRNA的表达

为了检测miR-148a在AP腺泡细胞中的作用，我们转染miR-148a mimics及阴性对照 miR-148a至AR42J细胞后，用TLCs刺激20 min，然后检测各组细胞中miR-148a的表达变化，结果见图1，与正常对照组相比较，模型组细胞中miR-148a mRNA的表达下降(P=0.000 6)，与阴性对照 miR-148a组相比较，二者无差异；与模型组及正常对照组相比较，miR-148a mimics组细胞中miR-148a mRNA的表达均升高(P=0.000 4，P=0.000 8)，细胞中miR-148a的表达升高，说明miR-148a mimics成功转染至AR42J细胞中。

图1 各组细胞中miR-148a mRNA的表达(***P<0.001)

2.2 各组细胞活性

结果见图2，与正常对照组相比较，模型组细胞的活性降低(P=0.000 8)，而与阴性对照miR-148a组相比较，两组细胞活性无明显差异；与模型组相比较，miR-148a mimics组细胞活性升高(P=0.005)，而与正常对照组比较，其细胞活性仍低于正常对照组中细胞的活性(P=0.009)。

图2 利用CCK- 8实验检测各组细胞活性(**P<0.001，***P<0.001)

2.3 各组细胞培养液中炎性因子IL- 6、IL-1β、TNF-α的含量

与正常对照组相比较，模型组细胞培养液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL- 6的含量升高(P=0.004,P=0.003,P=0.006)，而与阴性对照miR-148a组相比较，两组细胞培养液中炎性因子的含量无差异；与模型组相比较，miR-148a mimics组细胞培养液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL- 6的含量降低(P=0.005,P=0.000 7,P=0.001)，而与正常对照组比较，它们的含量仍高于正常对照组中细胞培养液中的含量。见表1。

表1 各组细胞培养液中炎性因子IL- 6，IL-1β，TNF-α的含量

2.4 各组细胞中Beclin1，LC3蛋白的表达变化

Western blot结果见图3，与正常对照组相比较，模型组细胞中Beclin1的表达升高(P=0.000 9)，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率也升高(P=0.000 6)，而与与阴性对照miR-148a组相比较，二组细胞中Beclin1的表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率无差异；与模型组相比较，miR-148a mimics组细胞中Beclin1的表达降低(P=0.004)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率也降低(P=0.000 7)，而与正常对照组比较，miR-148a mimics组细胞中Beclin1的表达升高(P=0.000 4)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率也升高(P=0.000 3)。

3 讨 论

AP是一种发展迅速的炎症性疾病，因其发病机制尚不明确，缺乏特异性靶点，临床常用于AP治疗方法的疗效并不理想，使其在全世界范围内发病率和死亡率都处于较高水平[1,6]。最近，AP中基因表达的改变和信号通路的影响越来越受到研究者的关注。

microRNA的发现和研究，为AP诊断和治疗提供了新的思路。miR-148a为微小RNA的一种，近年来越来越多的研究显示miR-148a在疾病的发生发展中发挥着的重要作用。在肿瘤的发生发展中，miR-148a可通过抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，诱导肿瘤细胞的凋亡，成为肿瘤治疗的新的靶点[7- 9]。miR-148a可通过抑制蛋白激酶B(AKT)信号通路，从而抑制小鼠胰腺祖细胞的分化、增殖过程[10]。死亡患者血清miR-148a 相对表达量低于生存患者，提示miR-148a可能与急性胰腺炎患者的预后存在联系[5]。并且，在肝脏星状细胞的凋亡与自噬中，miR-148a发挥着重要作用，那么miR-148a在急性腺泡细胞损伤中发挥着什么样的作用还少见报道。

本研究中，我们利用AR42J细胞的AP模型，转染miR-148a mimics至细胞中，结果显示，AP模型组细胞中miR-148a mRNA的表达显著低于正常对照组与miR-148a mimics组，这也与Miao B等人的动物实验结果相一致[11]；同时AP模型组细胞活性也显著低于正常对照组与miR-148a mimics组。Li G等人的研究表明，miR-148a通过调节p38/丝裂原活化蛋白激酶途径抑制椎间盘退变中促炎细胞因子[12]，Jiang K等人的研究也显示，过表达miR-148a可显著降低促炎细胞因子的产生，如IL-1β和TNF-α等[13]。我们的研究结果也显示，与AP模型组细胞相比较，miR-148a mimics组细胞培养液中促炎因子IL- 6，IL-1β，TNF-α的含量显著降低，这也与他们的研究结果相一致。这就提示，AP时细胞中miR-148a的表达降低，细胞的活性降低，促进细胞损伤，促进炎性因子的释放，通过提高miR-148a的表达，可提高细胞的活性，降低细胞的损伤，减少炎性因子的释放，对细胞起到一定的保护作用。

自噬是一个受调控的过程，是一种程序性细胞死亡的形式，其在许多疾病中也起着重要作用，大量的研究也显示，自噬参与AP的发生发展过程[14-16]。而众多的微小RNA也可通过调节细胞的自噬参与多种疾病的发病过程[17- 20]。郑绍越等人的研究显示，转染miR- 383 类似物后，细胞中Beclin1表达水平及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值下调，miR- 383可以降低急性胰腺炎时细胞自噬水平[3]，而miR-148a是否可通过调节细胞的自噬参与AP中腺泡细胞的损伤?

本研究中，我们的实验结果显示，AP模型组细胞中Beclin1的表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率显著高于正常对照组，而miR-148a mimics组细胞中Beclin1的表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率显著低于模型组，这就提示，提高模型细胞中miR-148a 的表达后，可抑制自噬相关蛋白Beclin1的表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率，抑制自噬过程，这也与Miao B等人的实验结果相一致[11]。

综上所述，miR-148a可通过抑制AP过程中腺泡细胞的自噬，减少促炎因子的释放，减轻细胞损伤，提高细胞活性，从而发挥对细胞的保护作用。