不同前列腺特异性抗原检测方法在前列腺癌根治术后随访中的应用

韩志峰，谷费菲，刘 晨，丁文洁

1.中国人民解放军东部战区总医院普通外科实验室，江苏南京 210002；2.中国人民解放军东部战区空军医院检验科，江苏南京 210000

在接受前列腺癌根治术的患者中，术后10年复发率高达17.00%～53.00%，且大部分患者复发时多处于术后2～3年[1-2]。血清前列腺特异性抗原(PSA)是前列腺癌诊断的常用标记物之一，在早期前列腺癌患者行前列腺癌根治术后，若血清PSA水平降低至谷底(最低值)后连续2次上升>0.2 ng/mL，则定义为生化复发[3]。生化复发要比临床症状更早出现，且生化复发后的数月甚至数年才能通过影像学发现病灶，因此生化复发常被作为前列腺癌复发的最佳早期预测指标[4]。此外，术后随访中基于PSA水平的增高进行干预，较临床复发后干预更有助于改善患者的无癌生存率及预后。但目前常规PSA检测存在一定弊端，前列腺癌根治术后有相当一部分血清PSA浓度<1 pg/mL的患者未被检测到[5-6]。本研究探讨了超敏PSA免疫分析测定法在前列腺癌根治术后随访中应用的可行性，以及现代超灵敏检测技术是否可以提高此类患者的PSA监测水平。

1 资料与方法

1.1一般资料 将于中国人民解放军东部战区总医院或东部战区空军医院行前列腺癌根治术的20例术后患者的血清样本进行研究。纳入标准：(1)符合早期前列腺癌诊断标准及前列腺癌根治术适应证[7]；(2)术后PSA浓度均<100 pg/mL；(3)患者知情同意并签署知情同意书。排除标准：(1)合并免疫性疾病或免疫缺陷；(2)合并其他恶性肿瘤；(3)合并肝、肾功能不全等机体重要器官损害；(4)术后随访时间<2年，且连续收集血清次数<4次。入选患者均为男性，年龄51～72岁，中位年龄60岁。每例患者在5个术后随访时间点收集血清样本，随访时间点的术后平均天数分别为79 d、302 d、616 d、810 d、1 021 d以及1 293 d，在中位随访时间3.5年内(范围2～6年)共收集了100个样本，样本检测前均置于-80 ℃的环境中存放。患者确诊时年龄、术前PSA水平等基本情况见表1。

表1 20例前列腺癌根治术患者的基本情况

1.2方法 分别采用酶联免疫吸附法(ELISA)与超敏PSA检测法测定患者术后不同时间的PSA水平。

1.2.1ELISA法 采用上海信帆生物公司生产的人PSA试剂盒，严格按照说明书对同一组纵向样本中的PSA水平进行检测，PSA水平为总PSA水平，包括了血清游离PSA和与α1-抗胰凝乳蛋白酶结合的PSA。所有的血清样本均与8个校准品一式三份进行测量，来自同一患者的系列样品在同一微孔板中运行，以最大程度地减少技术差异。

1.2.2超敏PSA检测法 采用基于电化学发光法的MesoScale Discovery来检测血清中的复合PSA，试剂盒为罗氏公司生产的总PSA定量测定试剂盒，并严格按照说明书操作，来自同一患者的系列样品在同一微孔板中运行，以最大程度地减少技术差异。

1.3统计学处理 采用Pearson相关性系数分析超敏PSA检测法的精度和准确性，两种检测方法对生化复发的术后诊断时间差异采用Mann-Whitney检验，二分型的组织病理学资料比较采用Fisher精确检验，其余如年龄、术前PSA及Gleason评分等的比较采用Mann-WhitneyU检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1超敏PSA检测法的可靠性 采用超敏PSA检测法成功对100个样本的PSA水平进行了定量分析，检测下限(LLD)为0.003 pg/mL，重复测量的样本之间具有极强的相关性(r=0.99，P<0.01)。同时，96个(96.00%)重复测量样本的批内精密度相对标准偏差(CV)<10.00%，PSA浓度范围为0.084～119.021 pg/mL，见图1A。此外，使用ELISA仅在38个样本中检测到了PSA，LLD为1 pg/mL，超敏PSA检测法测得的对应样本的PSA浓度与其具有极强的相关性(r=0.91,P<0.01)，见图1B。

图1 超敏PSA检测的可靠性散点图分布情况

2.2两种方法对血清PSA的纵向监测情况 使用ELISA法检测20例患者中有7例符合生化复发标准[3]，见图2A。另外13例患者血清PSA未显示连续的增高，其中有7例患者在所有随访时间点的PSA浓度无法测出，见图2B。而超敏PSA检测法检测20例患者中有8例符合生化复发标准，见图3A。另外12例患者血清PSA未显示连续的增高，见图3B。超敏PSA检测法术后诊断生化复发的时间中位数为948 d，ELISA法为1 015 d，两者差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 ELISA法检测的血清PSA的纵向变化曲线

图3 超敏PSA检测的血清PSA的纵向变化曲线

2.3两种检测方法诊断生化复发与未复发患者的临床和病例学特征比较 两种检测方法诊断为生化复发患者的Gleason评分均明显高于未复发组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图4。其余如年龄、术前PSA、精囊受累、周围组织浸润等临床和病例学特征差异均无统计学意义(均P<0.05)。

注：有2例患者资料缺失，A为ELISA法，B为超敏PSA检测法。

3 讨 论

PSA监测是前列腺癌根治术后生化复发的重要判断工具，在关键时期开始实施挽救治疗能最大程度改善预后。但很多患者的术后PSA采用常规ELISA法无法检测到，PSA“缺失”可能长达数月或者数年，漏诊的可能性较大[8-9]。随着超敏PSA检测技术的出现，大大提高了检测灵敏度，但应充分分析因其带来的优势及风险，以确保临床决策基于可靠且有意义的实验室结果，并避免反复发作的过度诊断和过度治疗。

MesoScale人复合PSA检测法的LLD为0.003 5 pg/mL，是迄今为止报道最灵敏的PSA检测方法之一，可与之比较的超敏PSA技术包括基于金纳米颗粒、单分子阵列和基于超顺磁珠的阵列测定(LLD 0.003～0.05 pg/mL)[10-12]。SCHUBERT等[11]报道，采用单分子阵列技术发现血清PSA水平>0.05 pg/mL时CV<20.00%，而PSA在1～50 pg/mL时则CV<10.00%，可见采用超敏PSA检测法的精度更好。而本研究采用超敏PSA检测法结果发现重复测量的样本之间具有极强的相关性，测定PSA浓度最低值为0.084 pg/mL，而且测定的内变异性较低、精度较高(96.00%的样本CV<10.00%)，与既往采用ELISA法重复测定未经稀释血清样品CV值<10.40%的报道一致[13]。在前列腺癌之外，众所周知女性血清中PSA浓度较低(<1 pg/mL)，因此超敏PSA检测还有望满足各种医学背景下女性PSA水平的监测需求。

为了进一步探寻低浓度(<1 pg/mL)的PSA动力学是否能够为生化复发提供临床指导，本研究发现使用ELISA法监测(LLD为1 pg/mL)时，有80.00%的前列腺癌患者在根治术后第1时间点均显示PSA缺失，这些患者中有一半以上在术后约1～2年的随访中可检测到PSA增加。同时，考虑到由于许多复发性前列腺癌病例会在2年内出现[14]，因此在此期间监测当前无法检测到的PSA理论上可以早期检测某些患者的生化复发。此外，既往一项为期5年的随访研究表明[15]，ELISA分析灵敏度的提高使得生化复发的检测时间比传统分析方法早了18个月。而本研究结果则提示，超敏PSA检测法尽管其灵敏度提高到了0.003 pg/mL，但与ELISA检测术后生化复发的时间比较差异无统计学意义(P>0.05)，与前述报道并不一致，也可能与本研究的样本量有关。

本研究采用超敏PSA检测法在0.003～1 pg/mL范围内检测PSA水平时，根据ELISA法评估为无生化复发的前列腺癌根治术患者中有1例(5.00%)符合生化复发标准，该例患者(P7)的所有血清样本在使用ELISA法测定时均检测不到PSA，而超敏PSA检测法在术后第2个随访时间点(术后250 d)至最后一个随访时间点(术后1 297 d)的PSA测量值出现了稳定升高，从0.32 pg/mL上升到4.40 pg/mL(图3A)。说明单个患者在2.9年中的PSA增加了14倍，因为相当低的PSA浓度，基于此信息的临床行动应保持怀疑态度。笔者建议仍然使用ELISA法监测的临床价值更高。

本研究结果还提示，患者之间和患者内部PSA在<2 pg/mL时存在的较大幅度变化，这可能是由于生物学(日常)变化，例如分泌非前列腺组织的PSA。此外，有3例无生化复发的患者(P11、P16及P17)，PSA动力学在<2 pg/mL的低水平下存在很大的不确定性，他们从最低点连续出现了2次PSA升高，总体升高幅度极大，然后在随后的时间点该值急剧下降(图3B)。很明显，在如此低的浓度(<2 pg/mL)下PSA的变化可能不够可靠，无法预测生化复发的征兆或触发临床决策。一项基于纳米颗粒生物条形码PSA分析(LLD为0.33 pg/mL)的研究报道发现[16]，<5 pg/mL的变化不能预测前列腺癌复发，而PSA单调升高>5 pg/mL则可预测生化复发。结合本研究结果提示，ELISA检测的性能似乎足以指导临床操作。

将临床病理信息与PSA监测相结合对前列腺癌根治术后生化复发的监测具有重要意义。PSA浓度升高至标准阈值200 pg/mL以下仅可预测Gleason评分>8分、精囊浸润、手术切缘阳性及前列腺外扩张等高危因素患者的复发[17]。而欧洲泌尿外科协会的新前列腺癌指南将复发的最主要不利预后因素确定为Gleason评分为8～10分，PSA倍增时间<1年[18]。本研究发现Gleason评分较高与生化复发状态相关，但与其他高风险因素之间没有关系。可能归因于本研究中包括的患者数量较少。

综上所述，本研究超敏PSA检测法能够跟踪血清PSA 0.003 5～1 pg/mL范围内的微小变化，比ELISA法灵敏度高，且对超敏PSA工具的技术实用性提供了全面报告。但在PSA低浓度下监测可能会导致前列腺癌根治术后生化复发结果不可靠，还是建议采用ELISA法进行前列腺癌根治术后PSA的随访检测。