circRNA_000203与心力衰竭患者心功能及预后的关系研究*

刘国銮,黄汝刚,杨彩霞,刘晓红

铁岭市中心医院循环内科,辽宁铁岭 112000

心力衰竭(简称心衰)是心功能异常引起心脏射血功能及心室充盈受损，最终导致心室泵血功能下降的临床综合征[1]。心衰患者的病死率较高，预后较差，生活质量受到严重影响[1-2]。深入分析心衰的病理机制并寻找潜在的生物学指标有重要意义。环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解[3]。有研究显示，circRNA与心功能有关，能参与心衰的病情进展[4-5]。circRNA_000203在糖尿病小鼠心肌组织中表达上调，具有促纤维化作用。也有研究发现，circRNA_000203与心功能受损有关，可促进心肌肥厚[6]。外周血circRNA水平高于相应线性RNA水平，在血液中的水平高于肝脏、心脏和小脑组织，有可能成为血液标本中的分子生物学标志物[7]。本研究检测了心衰患者血清中circRNA_000203表达水平，并分析了其与心衰患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年6月至2019年1月本院收治的124例急性心衰患者作为心衰组，其中男68例，女56例；年龄57～74岁，平均(64.01±9.79)岁；平均体质量指数(22.13±3.01)kg/m2；收缩压(116.89±10.02)mm Hg；舒张压(75.03±6.03)mm Hg；总胆固醇(4.47±1.35)mmol/L；三酰甘油(1.50±0.76)mmol/L。根据心衰患者纽约心脏病协会(NYHA)分级[8]：Ⅱ级36例，Ⅲ级45例，Ⅳ级43例；基础疾病：瓣膜性心脏病37例，缺血性心脏病32例，高血压性心脏病28例，扩张性心脏病27例。纳入标准：(1)符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》中心衰的诊断标准[9]；(2)年龄≥18岁；(3)NYHA分级≥Ⅱ级；(4)随访资料完整。排除标准：(1)严重的肝肾功能异常；(2)合并急慢性感染；(3)肿瘤；(4)免疫系疾病；(5)精神疾病。

另选取同期本院体检中心体检的120例体检健康者作为对照组，其中男61例，女59例；平均(62.89±10.12)岁；平均体质量指数(23.06±4.11)kg/m2；收缩压(120.84±15.90)mm Hg；舒张压(81.43±8.75)mm Hg；总胆固醇(4.26±1.47)mmol/L；三酰甘油(1.39±0.51)mmol/L。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已经过本院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2血清circRNA_000203和氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)水平检测 入组时抽取空腹静脉血5 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中，3 500 r/min离心5 min，留取血清于EP管中，并保存于-80 ℃冰箱中。荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测：用TRIzol试剂盒(上海百研生物科技有限公司)提取总RNA，随后用Thermo Nano Drop3000紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，保证A260/A280比值在1.8～2.0。用反转录试剂盒(上海百研生物科技有限公司)将RNA反转录为cDNA，以cDNA模板进行FQ-PCR(内参为GAPDH)，SYBRⅡ试剂盒购于北京百奥莱博科技有限公司。实时荧光定量PCR检测仪为美国ABI公司生产。以2-ΔΔCt表示circRNA相对表达水平[10]。引物序列：circRNA_000203上游 3′-CGA GCT GAG TGC GTC CTG TC-5′；下游′-TCG CTG GCC GTG AGT CTG T-5′；GAPDH上游5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′；下游5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。用UniCel DxI全自动化学发光仪及其配套试剂盒(美国贝克曼库尔特有限公司)检测NT-proBNP水平。

1.3心功能检测 用IE33彩色多普勒心脏超声系统(荷兰飞利浦公司)检测受试者左心室射血分数(LVEF)、左心房内径(LAD)、左心室舒张末期内径(LVDd)。

1.4随访 对所有心衰患者进行门诊和电话随访，纳入研究的患者均获得有效随访。心衰不良预后定义为再次发生心衰或死亡。

2 结 果

2.1两组血清指标和心功能指标比较 心衰组circRNA_000203、NT-proBNP、LAD和LVDd高于对照组，而LVEF低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组血清指标和心功能指标比较

2.2不同NYHA分级心衰患者血清circRNA_000203表达水平比较 Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级心衰患者血清circRNA_000203相对表达水平分别为1.89±0.87、2.97±0.69、4.57±1.03，经方差分析，差异有统计学意义(P<0.001)，分级越高，血清circRNA_000203表达水平越高，见图1。

注：与Ⅱ级患者比较，*P<0.05；与Ⅲ级患者比较，#P<0.05。

2.3心衰患者血清circRNA_000203表达水平与NT-proBNP、心功能指标的关系 circRNA_000203表达水平与NT-proBNP、LAD、LVDd呈正相关(r=0.678、0.411、0.409，P<0.05)，而与LVEF呈负相关(r=-0.555，P<0.05)，见表2。

表2 血清circRNA_000203表达水平与NT-proBNP、心功能指标的关系

2.4不同预后患者血清circRNA_000203表达水平比较 124例患者中预后不良44例，其中再发心衰30例，死亡14例。预后不良患者circRNA_000203相对表达水平为4.56±1.10，高于预后良好患者1.90±0.94，差异有统计学意义(t=13.544，P<0.05)，见图2。

注：与预后不良心衰患者比较，*P<0.05。

2.5Logistic多因素分析心衰患者不良预后的影响因素 circRNA_000203、NT-proBNP、LAD、LVDd和LVEF是影响心衰患者预后的独立因素(P<0.05)，见表3。

表3 Logistic多因素分析心衰患者不良预后的影响因素

续表3 Logistic多因素分析心衰患者不良预后的影响因素

2.6ROC曲线分析circRNA_000203预测心衰患者不良预后的价值 circRNA_000203预测心衰患者不良预后的AUC为0.756，当circRNA_000203取值为2.87时约登指数最大(0.539)，即诊断价值最高，此时灵敏度和特异度分别为65.03%和88.95%，见图3。

图3 ROC曲线分析circRNA_000203预测心衰患者不良预后的价值

3 讨 论

心衰是临床常见疾病，深入分析其发病机制并寻找潜在生物学标志物具有重要意义。circRNA在心衰中的作用引起了广泛重视，例如心脏相关circRNA(HRCR)可以靶向作用于miR-223从而调控ARC基因表达，进而介导心肌肥大和心衰的发生[11]。本研究旨在分析circRNA_000203与心衰患者心功能及预后的关系。

circRNA广泛存在于各种生物细胞中，可参与基因表达调控，具有稳定性、高度保守性和组织发育特异性[12]。circRNA通过外泌体分泌入血液，在不易获取病理组织的疾病中，检测外周血circRNA可能会作为一种新型诊断疾病的方法[12-14]。circRNA在心衰的诊断及鉴别诊断、病情评估和预后评估中显示出了良好的应用前景[15]。既往研究显示，circRNA_000203与心肌纤维化、心肌肥厚和结构重塑有关[6,16]。 但是鲜有研究检测心衰患者外周血中该指标的表达及意义。本研究发现心衰患者circRNA_000203表达水平明显高于健康者，并且NYHA分级越高，表达水平越高。提示circRNA_000203可能参与了心衰的发生。

circRNA_000203表达量与NT-proBNP、LAD、LVDd呈正相关关系，而与LVEF呈负相关关系，说明circRNA_000203有助于心功能的评估。circRNA_000203与心衰进展中的作用机制既往少有报道。TANG等[16]发现，circRNA_000203可能通过抑制miR-26b-5p、Col1a2和CTGF促进心肌纤维化。有研究显示，circRNA_000203过表达会提高心室肌细胞心钠素及β肌球蛋白重链的表达；在circRNA_000203转基因小鼠中，用血管紧张素Ⅱ干预后，小鼠心脏功能受损，心肌肥厚加重，上述作用可能是circRNA_000203通过抑制miR-26b-5p和miR-140-3p引起GATA4表达上调而实现的[6]。本研究发现，circRNA_000203是心衰患者不良预后的独立影响因素，预后不良患者circRNA_000203相对表达水平为4.56±1.10，高于预后良好患者1.90±0.94。另外，circRNA_000203预测心衰患者不良预后的AUC为0.756，提示该指标对早期预测心衰预后有一定价值。但是circRNA_000203预测心衰的灵敏度仅65.03%，可能与检测手段、病情严重程度等有关，联合其他指标进行预测可能会提高其诊断灵敏度。

综上所述，心衰患者血清circRNA_000203表达水平升高，检测其表达水平可能有助于评估心功能和患者预后。本研究也存在以下局限性：(1)本研究为回顾性研究，可能存在回忆偏倚和选择偏倚；(2)未在患者入院时动态检测circRNA_000203表达水平；(3)未分析circRNA_000203在心衰中的作用机制。未来需要开展细胞和动物研究进行深入分析。