β-catenin通过ASK1抑制铜绿假单胞菌引起的炎性反应*

傅 强,王伟佳,黄福达,缪丽韶，杨山虹，陈 康

中山市人民医院检验医学中心，广东中山 528403

铜绿假单胞菌是广泛分布于自然界的细菌，是引起慢性感染和医院感染常见的病原体之一，可引起尿路感染、肺部感染、皮肤感染、角膜感染等[1-2]。天然免疫和参与天然免疫的初始免疫细胞(如巨噬细胞)是病原体感染时发挥免疫防御作用的第一道防线。病原体感染启动机体的炎性反应，激活的炎性反应可以促进病原体的清除，然而，过度的炎性反应会造成机体的免疫病理损伤[1-2]。因此，如何发挥机体的免疫防御功能，同时抑制过度炎性反应造成的病理损伤在感染性疾病中至关重要。

β-catenin是经典Wnt通路中的核心分子，当Wnt信号通路被激活后，β-catenin在胞浆中聚集并转位至胞核，调节细胞的多种病理、生理过程。有研究报道，β-catenin可在自身免疫性疾病[3]、炎症相关的疾病[4-5]及多种病原体感染[6-7]中发挥重要的免疫调控作用。在以往研究中发现，当感染铜绿假单胞菌时，β-catenin会抑制角膜的炎性反应[6]。然而，β-catenin在铜绿假单胞菌感染中的免疫调控机制尚不清楚。凋亡信号调节激酶1(ASK1)是科学家于90年代发现的有丝分裂原激酶(MAPK)上游的信号分子，通过调节c-Jun氨基末端激酶(JNK)MAPK和P38 MAPK参与天然免疫调控和炎症性疾病[8-11]。β-catenin通过ASK1调节P38在内毒素血症中发挥炎症调节作用[12]。那么，ASK1在铜绿假单胞菌感染中的作用如何，β-catenin是否通过ASK1在铜绿假单胞菌感染中发挥免疫调控作用还有待于进一步的研究。

1 材料与方法

1.1细胞培养 RAW264.7细胞、过表达β-catenin的RAW264.7细胞和对照细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)条件下培养[6]。ASK1质粒购自addgene公司，按照说明书采用阳离子脂质体2 000转染，以5 μg的终浓度应用于细胞，进行后续回复实验。siASK1购自Santacruz公司，按照说明书采用阳离子脂质体2 000转染，以5 μmol/L的终浓度应用于细胞，进行后续检测。

1.2普通聚合酶链反应(PCR) 采用TRIzol法提取细胞的RNA，用反转录试剂盒转录成cDNA，采用PCR扩增试剂盒进行普通PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，UVP成像系统观察扩增条带。ASK1的引物序列见表1。

1.3实时荧光定量PCR(Real-time PCR) 采用TRIzol法提取细胞的RNA。用反转录试剂盒转录成cDNA，采用SYBR Green按照试剂盒说明书配制反应体系进行Real-time PCR。扩增结果采用2-ΔΔCt法分析细胞中白细胞介素6(IL-6)、IL-1β的基因表达。IL-6、IL-1β和β-actin的引物序列，见表1。

表1 引物序列

1.4Western-blot 收集细胞的蛋白样品，经SDS-PAGE后转膜至硝酸纤维膜上，分别孵育5%脱脂奶粉、ASK1(1∶1 000)的一抗、抗兔二抗。经曝光后观察目的蛋白的水平。

1.5铜绿假单胞菌角膜炎动物模型的构建 铜绿假单胞菌角膜炎动物模型构建参考以往研究[6]。简述如下：选取6～8周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠20只，麻醉后划伤左眼角膜并滴加铜绿假单胞菌菌液，构建角膜炎模型。分别于1、3、5 d观察角膜的浑浊程度和范围，进行临床评分，并于感染5 d拍摄角膜的裂隙灯照片。临床评分标准：0级，角膜清澈或轻度浑浊；+1级，角膜轻度浑浊，部分或完全遮盖眼前段；+2级，角膜中度浑浊，完全遮盖眼前段；+3级，角膜高度浑浊，完全遮盖眼前段；+4级，角膜溃疡穿孔。结膜下注射siASK1和siNC以10 μmol/L的终浓度应用于动物模型，进行后续实验。

2 结 果

2.1β-catenin抑制ASK1转录水平和蛋白的表达 为了探讨β-catenin抑制铜绿假单胞菌感染诱导的炎性反应的机制，在过表达β-catenin的RAW264.7细胞和对照细胞中检测差异表达的mRNA。实验结果显示过表达β-catenin可以抑制ASK1 转录水平，与对照组相比，ASK1 mRNA水平降低了2.6倍，差异有统计学意义(P<0.001)。采用PCR和Wester-blot的方法进一步验证ASK1转录水平和蛋白的表达，结果发现过表达β-catenin明显抑制了ASK1转录水平(图1A)和蛋白(图1B)的表达。

注：在过表达β-catenin的RAW264.7细胞和对照细胞中采用普通PCR的方法(A)和Western-blot的方法(B)检测ASK1转录水平和蛋白的表达。

2.2沉默ASK1抑制铜绿假单胞菌感染后的炎症因子的表达 ASK1作为调节天然免疫和炎性反应的重要分子，在铜绿假单胞菌感染中的作用还未知。为了探讨ASK1在铜绿假单胞菌感染中的免疫调控作用，本文应用ASK1的siRNA在转录水平沉默ASK1基因，实验结果发现，铜绿假单胞菌感染后，沉默ASK1可以抑制炎症因子IL-6(图2A)和IL-1β(图2B)基因水平的表达。

注：在RAW264.7细胞中采用阳离子脂质体2 000转染siASK1沉默ASK1的表达，与对照组siNC转染组相比，在铜绿假单胞菌感染前后，采用Real-time PCR的方法检测炎症因子IL-6(A)和IL-1β(B)的表达；数据来源于3次独立实验，用来表示，***P<0.001。0 h和6 h分别表示铜绿假单胞菌未感染及感染后6 h。

2.3沉默ASK1抑制铜绿假单胞菌感染的角膜炎性反应 铜绿假单胞菌角膜炎是急性化脓性角膜炎，该病的致病机制主要是由过度炎性反应造成的免疫病理损伤。为了进一步确认ASK1在铜绿假单胞菌感染诱导的炎性反应中的调控作用，构建铜绿假单胞菌角膜炎的动物模型，沉默ASK1观察疾病变化。临床评分结果发现，沉默ASK1后，在感染后3 d和5 d，临床评分降低(图3A)。裂隙灯结果显示，沉默ASK1后角膜重度浑浊覆盖眼前端，临床评分为+3(图3C)，而对照组角膜溃疡穿孔，临床评分为+4(图3B)。Real-time PCR结果显示，在铜绿假单胞菌感染5 d后，沉默ASK1可以抑制IL-6(图3D)和IL-1β(图3E)的表达。应用铜绿假单胞菌角膜炎的动物模型，体内实验再次验证沉默ASK1可以抑制铜绿假单胞菌感染引起的炎性反应。

注：构建铜绿假单胞菌角膜炎动物模型，根据角膜的炎症程度和炎症的浸润范围判断临床评分(A)，实验组和对照组各10只小鼠，*P<0.05，**P<0.01；拍摄siASK1处理后铜绿假单胞菌感染5 d小鼠角膜(C)和对照组小鼠角膜(B)；采用Real-time PCR，在角膜炎5 d检测siASK1和对照组siNC组小鼠角膜IL-6(D)和IL-1β(E)的表达；数据来源于3次独立实验，用来表示，*P<0.05，**P<0.01。

2.4β-catenin通过ASK1抑制铜绿假单胞菌引起的炎性反应 以上实验结果发现，β-catenin可在转录水平和蛋白水平抑制ASK1，同时发现沉默ASK1可在铜绿假单胞菌感染的体内外模型中抑制炎性反应。那么，β-catenin是否通过抑制ASK1发挥免疫调控功能呢？实验结果发现，在过表达β-catenin的同时过表达ASK1可减弱炎症因子IL-6(图4A)和IL-1β(图4B)表达的抑制作用。

注：在过表达β-catenin的RAW264.7细胞和对照RAW264.7细胞中采用阳离子脂质体2000转染ASK1质粒，上调ASK1的表达，在铜绿假单胞菌感染前后，采用Real-time PCR的方法检测炎症因子IL-6(A)和IL-1β(B)的表达；数据来源于3次独立实验，用来表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 讨 论

Wnt/β-catenin是进化高度保守的信号通路，β-catenin是经典Wnt通路中核心分子。当通路被激活时，β-catenin转位至细胞核内诱导下游基因的表达，参与多种生理和病理过程[3-7]。有文献研究发现，在铜绿假单胞菌感染时，β-catenin抑制感染细胞和角膜的炎性反应[6]。然而，β-catenin在通路假单胞菌感染中的免疫调控机制尚不清楚。

ASK1是免疫调控的重要分子，可通过JNK MAPK和P38 MAPK参与天然免疫调控和炎症性疾病[8-9]。有研究报道，在幽门螺杆菌感染时，ASK1参与细胞凋亡和炎性反应，从而参与胃癌的发生[10]；爱德华菌属中的新型毒素可通过ASK1-MAPK通路促进疾病的发生[11]。然而，ASK1在铜绿假单胞菌感染中的免疫调节作用还未知。本研究发现，在铜绿假单胞菌感染的细胞模型和动物模型中，沉默ASK1可在细胞模型和动物模型中抑制炎性反应。

有研究报道，在内毒素血症中，β-catenin可抑制ASK1-P38信号通路，抑制内毒素引起的炎性反应[12]；在脆弱拟杆菌肠毒素刺激下，β-catenin通过抑制NF-κB的活性抑制IL-8的表达，抑制炎性反应[13]；在化学剂硫酸吲哚酚诱导的炎性反应中，β-catenin可通过抑制巨噬细胞向M1极化抑制炎性反应[14]；在肾脏炎性反应中，β-catenin通过与Foxo相互作用诱导T细胞向Treg转化，抑制肾脏纤维化和炎性反应[15]。然而，在铜绿假单胞菌感染中，β-catenin调节炎性反应的分子机制还有待于进一步研究。本研究发现，β-catenin可以在转录水平和蛋白水平抑制ASK1的表达；进一步研究发现，ASK1可减弱β-catenin对炎症的抑制作用。这些结果提示，β-catenin通过调控ASK1抑制铜绿假单胞菌感染诱导的炎性反应。

本研究发现，在过表达β-catenin的RAW264.7细胞中ASK1的转录水平和蛋白水平明显降低；沉默ASK1可在铜绿假单胞菌感染的细胞模型和动物模型中抑制炎性反应；进一步实验发现，ASK1可减弱β-catenin对炎症的抑制作用。综上所述，β-catenin通过调控ASK1抑制铜绿假单胞菌感染引起的炎性反应。