一起人腺病毒55型引起的儿童发热暴发疫情病原学鉴定

刘师文，熊英，李健雄，张艳妮，徐刚，肖芳，刘晓庆，龚甜

（江西省疾病预防控制中心疾病检测所，江西 南昌 330029）

人腺病毒55型（Human adenovirus type 55，HAdV-55）是2006年中国首次在呼吸道感染疫情中分离鉴定的一个新基因型人腺病毒[1]。该病毒是由腺病毒B组HAdV-14和HAdV-11重组进化而来，其基因骨架来自引起呼吸道感染的HAdV-14，部分六邻体（Hexon）基因来自引起泌尿道感染的HAdV-11[2]。HAdV-55感染主要导致急性呼吸道感染以发热、咳嗽、咽痛和咳痰为主要临床表现，易并发肺炎[3]。与亲本HAdV-14及呼吸道腺病毒HAdV-3、HAdV-7相比，HAdV-55的传播能力更强，发热和肺炎的比例更高，暴发流行的规模更大[3,4]。流行病学调查研究显示HAdV-55暴发以成人为主[5-7]，未见引起儿童暴发疫情的报道。

2020年8月江西某地出现一起儿童发热暴发疫情，本实验室根据临床症状和流行病学史，采集了3例患儿咽拭标本，采用TaqMan微流体芯片、病毒分离及全基因组测序技术对这起疫情的病原体进行鉴定，报告如下。

1.1 标本采集2020年8月21-8月24日江西省宜某县29名儿童先后出现发热，不同程度咽痛症状，所有儿童均于8月9日-8月23日在同一游泳馆学游泳。采集3例具有发热（38.5℃～40℃）、咽痛症状的患儿（7～9岁）咽拭子标本，冷藏运输条件下运送至本实验室进行检测。

1.2 核酸提取 采用Qiagen公司的QIAamp MinElute Virus Spin Kit试剂提取咽拭子样本和病毒分离物的核酸，具体操作参照试剂说明书。

1.3 病原种类确定 采用TaqMan Gene Expression Custom Array Card（Cat No：4342253，美国Applied Biosystems公司）微流体芯片技术对样本进核酸检测，病原包括腺病毒、流感病毒、冠状病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌等42种呼吸道病原体。根据TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix（Cat No：4444 432,美国Applied Biosystems公司）说明书要求配置预混液。每个样本取30μl的核酸模板加入到70μl的预混液中，混均，加入到检测板，离心后上机进行核酸扩增。采用ABI ViiA 7实时荧光定量PCR仪进行扩增,反应条件：50℃20 min；95℃2 min；95℃3s，60℃30s（收集荧光信号），45个循环。

1.4 人腺病毒Hexon基因片段扩增和序列测定采用巢式PCR对腺病毒阳性标本核酸Hexon基因片段进行扩增,引物序列及扩增方法参照文献[8],目的片段大小688bp-821bp(不同型别腺病毒目的片段大小有差异)。

扩增出Hexon基因产物琼脂糖电泳后切胶回收，回收产物采用美国ABI SeqStudio Genetic Analyzer一代测序仪进行基因序列测定。测序结果经Blast同源比对，确定与之同源性最高的基因序列。从Genbank下载腺病毒基因参考序列,采用MEGA7.0软件以最大似然法（Maximum Likelihood method,ML）构建Hexon基因片段序列系统进化树，确定腺病毒的基因型别。

1.5 病毒分离 采用Hep-2细胞对腺病毒阳性咽拭子标本进行病毒分离，方法参照文献[9]。

1.6 腺病毒分离株基因组序列测定 采用78对引物分段扩增腺病毒分离株的全基因组序列,引物序列和扩增方法参照文献[10]，扩增产物送至上海生物工程有限责任公司进行序列测定，运用CLC Genomics Workbench生物学软件对序列进行拼接，采用MEGA7.0软件以最大似然法构建腺病毒基因全序系统进化树。

2 结果

2.1 病原种类确定 共采集3名患儿咽拭子标本3份（样本编号：2020YQ522-524）。对3份样本进行42种病原的检测，其中有两种检测腺病毒引物，结果显示3份样本均为腺病毒阳性，见图1，流感病毒等其他41种病原均为阴性。

图1 微流体芯片检测扩增图

2.2 腺病毒Hexon基因扩增和测序 对3份人腺病毒核酸阳性标本Hexon基因片段进行扩增，PCR产物电泳图，见图2，三个样本均出现了目的条带。

图2 Hexon基因片段扩增产物电泳图

3个PCR产物经切胶回收后一代测序均获得长708bp的基因序列。测序结果经Blast同源比对,确定该3个序列与HAdV-55型同源性最高，其次为腺病毒B组HAdV-11。通过与HAdV-7、HAdV-3、HAdV-11、HAdV-14型 以及7株HAdV-55型参考株基因序列进行比对,并构建基因亲缘性关系树，见图3发现,2020YQ522、2020YQ523、2020YQ5 24均分布在B组HAdV-55一个分支上，和其他参考腺病毒型别相比，与HAdV-11亲缘关系最近。同源性分析发现2020YQ522、2020YQ523、2020YQ 524之间核苷酸序列同源性100%，与HAdV-55原型株（DS-DLL）的Hexon基因核苷酸序列同源性为100%。

图3 人腺病毒Hexon部分基因亲缘性关系树(409-1086bP)

2.3 腺病毒病毒分离 采用Hep-2细胞对咽拭子样本进行分离，其中2020YQ523、2020YQ524在接种后第二天开始出现细胞变圆,聚集如葡萄串状等典型腺病毒CPE病变特征,接种后第3d和第5d完全病变,最终成功分离到两株腺病毒（2020YQ 523、2020YQ524），2020YQ522未分离成功。

2.4 腺病毒分离株基因组序列与分析 选取病毒分离株2020YQ523核酸进行分段扩增测序，经序列拼接获得长34 443bp的基因序列。应用MEGA7.0软件比对分析显示获得的腺病毒基因组序列与HAdV-55原型株QS-DLL同源性最高，为99.99%，仅存在4个核苷酸差异，分别为核苷酸第1 721位（A-T）、8 394位（A-T）、22 904位（G-A）、28 827位（G-T），其中第1 721、22 904位核苷酸变异分别导致氨基酸发生了I-L、P-L的变异，第8 394、28827位核苷酸变异未导致氨基酸发生变异。

基于腺病毒全基因组构建的系统进化树见图4，由图可见2020YQ523分布在B组HAdV-55型分支，和其他参考腺病毒型别相比，该病毒与HAdV-14亲缘关系最近。

图4 基于腺病毒全基因组构建的系统进化树

3 讨论

腺病毒可通过不同基因型之前发生重组而产生新的基因型,HAdV-55就是由HAdV-14和HAdV-11在Hexon基因发生重组产生。张艳妮等[9]对江西省2010年至2014年2645份儿童呼吸道感染样本腺病毒基因型别进行研究未发现HAdV-55。本研究通过微流体芯片、病毒分离、基因组测序分析技术确定本次疫情病原体为HAdV-55。序列分析结果显示，与参考的其他型别腺病毒相比，2020YQ523毒株Hexon基因片段序列与HAdV-11亲缘关系最近，而全基因序列分析显示与HAdV-14亲缘关系最近，研究结果与朱小娟等一致[11]，进一步证实该病毒是由HAdV-14和HAdV-11重组病毒而来，对HAdV-55病原鉴定时应结合全基因序列分析的方法。这是江西省内首次发现由HAdV-55引起暴发疫情的报道，事件原因可能是因为游泳馆集中培训造成的人员交叉感染。

目前报道的HAdV-55的暴发疫情主要为成人[5-7]，尤其是在军营中[6,12]，其次是青少年（中学）[1,13]，尚未见儿童暴发疫情的报道。可能是基于现有研究报道，有研究提到了HAdV-55暴发流行感染人群的特殊性[14]，然而本次疫情涉及至少29名儿童，采集到样本的3名患儿分别为7、8、9岁，确定为一起儿童发热暴发疫情。结合HAdV-55在人群散发感染中的报道，如Xu等[15]通过对急性呼吸道感染儿童进行了5年的腺病毒监测，发现8例HAdV-55感染，患儿平均年龄0.73±0.78岁；本实验室曾在散发儿童急性眼结膜炎儿童中发现6例HAdV-55感染，患儿年龄4月～10岁[16]；Cao等[3]发现21例HAdV-55感染社区获得性肺炎病例均大于10岁，我们认为HAdV-55暴发流行感染不具有人群的特殊性，可能在各年龄人群暴发，而且可能不仅存在发热呼吸道疾病暴发风险，也存在急性结膜炎等暴发风险。

为了更好的应对由HAdV-55引起的暴发或者流行，急需建立有效的腺病毒监测体系，加强监测，掌握该病毒进化及流行情况，为其感染暴发的预测预警提供科学依据。