体外血管内皮生长因子单克隆抗体对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移力的影响

李俊，叶亮，王帆

体外血管内皮生长因子单克隆抗体对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移力的影响

李俊，叶亮，王帆

目的：在体外观察血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移力的影响。方法：采用氯化钴（CoCl2）模拟缺氧环境，予以0、0.1、1、10 μg/mL的VEGF抗体，对常氧或缺氧条件下对C6胶质瘤细胞进行处理。通过MTT实验检测细胞增殖，Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力，Western blotting检测HIF-1α蛋白、FAK/Pyk2总蛋白及磷酸化FAK-Tyr397/Pyk2-Tyr402表达水平变化。结果：200 μmol/L CoCl2明显抑制C6细胞增殖（P＜0.05），10 μg/mL VEGF抗体可明显抑制C6细胞增殖（P＜0.05）。与常氧相比，缺氧可使C6细胞的迁移、侵袭能力增强（P＜0.05）。常氧和缺氧下，VEGF抗体的干预均增强C6细胞的迁移、侵袭能力（P＜0.05），且相对于常氧，缺氧可进一步增强VEGF抗体促C6细胞迁移、侵袭的作用（P＜0.05）。CoCl2干预可增加C6细胞中HIF-1α的含量；在常氧和缺氧情况下，只有1 μg/mL VEGF抗体可降低FAK的总蛋白量（P＜0.05）；在缺氧情况下，VEGF抗体可明显增高Pyk2-Tyr402位点的磷酸化水平。结论：在缺氧情况下，VEGF抗体的干预可使Pyk2-Tyr402位点的磷酸化水平增高，引起C6细胞的侵袭迁移能力进一步增强。

胶质母细胞瘤；迁移；侵袭；缺氧；血管内皮生长因子

胶质瘤大约占颅脑肿瘤的70%以上，是最为常见的原发性神经系统恶性肿瘤，其中多形性胶质瘤母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）被认为是最恶性的胶质瘤（WHOⅣ级）[1,2]。针对新确诊的胶质瘤，目前主要采取以手术、放疗、化疗为主的综合治疗方案，但其预后不容乐观，确诊后平均生存期仅为14月[3,4]，而且大部分肿瘤会复发，对于复发型胶质瘤目前仍未有统一的标准治疗方案。本研究采用化学方法建立胶质瘤细胞缺氧模型[5,6]，观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移等生物学行为的影响，并初步探讨缺氧环境下，VEGF抗体对胶质瘤细胞侵袭迁移能力改变的有关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 大鼠C6胶质瘤细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。C6细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于5%CO2、37℃的密闭培养箱内（培养箱相对湿度为95%），每2～3 d更换一次培养基。倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞生长至70%～80%密度时，予以传代。

1.1.2 主要试剂 氯化钴（CoCl2）、丙烯酰胺/N、N-亚甲叉双丙烯酰胺（Arc/Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基磺酸钠（SDS）、甘氨酸（Glycine）购于美国Sigma公司；Tween-20、β-巯基乙醇购于美国Amresco公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白测定试剂盒购于美国Pierce公司；FAK/p-FAK（Tyr397）抗体、Pyk2/p-Pyk2（Tyr402）抗体、VEGF单克隆抗体、β-actin抗体、HRP标记的二抗购于美国Santa Cruz公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度CoCl2对C6细胞增殖的影响 取对数生长期的C6细胞，消化、吹打成单细胞悬液，计数后以每孔8×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL，每组设置5个复孔，于37℃含有5%CO2的培养箱中培养；细胞生长至60%～70%时弃去原培养基，每孔加入含有不同浓度CoCl2的培养基200 μL，使CoCl2终浓度分别为0 μmol/L（0 μmol/L组）、50 μmol/L（50 μmol/L组）、100 μ mol/L（100 μ mol/L组）、200 μ mol/L（200 μmol/L组），调零孔加入与实验组等体积的培养基，其余边缘孔加入等体积PBS，继续培养；处理24 h后取出培养板，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，于37℃温箱中孵育4 h，弃去孔内培养基，每孔加入200 μL二甲基亚砜（DMSO），将培养板放在水平摇床上震荡10 min，使结晶充分溶解；以空白孔调零，在酶联免疫检测仪检测490 nm波长处的每孔吸光度值（OD值），比较细胞活力改变。

1.2.2 不同浓度VEGF抗体对C6细胞增殖的影响 取对数生长期的C6细胞，消化、吹打成单细胞悬液，计数后以每孔8×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL，每组设置3个复孔，于37℃含有5%CO2的培养箱中培养；细胞生长至60%～70%时弃去原培养基，每孔加入含有不同浓度VEGF抗体的常氧或缺氧培养基200 μL，使VEGF抗体终浓度分别为0 μg/mL（0 μg/mL组）、0.1 μg/mL（0.1 μg/mL组）、1 μg/mL（1 μg/mL组）、10 μ g/mL（10 μ g/mL组），缺氧条件培养基中含100 μmol/L CoCl2，常氧条件培养基则不含CoCl2，调零孔加入与实验组等体积的培养液，其余边缘孔加入等体积PBS，继续培养；处理24 h后取出培养板，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，于37℃温箱中孵育4 h，弃去孔内培养液，每孔加入200 μL DMSO，将培养板放在水平摇床上震荡10 min，使结晶充分溶解；以空白孔调零，在酶联免疫检测仪检测490 nm波长处的每孔OD值，比较细胞活力改变。

1.2.3 Transwell体外迁移和侵袭实验 取对数生长期的C6细胞，消化、吹打成单细胞悬液，计数后以每孔1× 105个接种细胞于6孔培养板中，于37℃含有5%CO2的培养箱中常规培养；参照文献方法[7,8]进行体外迁移和侵袭实验，在倒置显微镜下观察，200×视野下任取5个不重复视野照相，并记数侵袭细胞数量。

1.2.4Western Blotting检测FAK、Pyk2总蛋白表达变化及其磷酸化水平的变化 按照试剂盒说明步骤制备蛋白样品，根据OD值和标准蛋白浓度在Excel中计算出直线回归方程，再根据蛋白样品OD值，用回归方程计算出样品蛋白浓度及上样量。按照试剂盒说明进行Western Blotting检测，photoshop CS 5和Image J软件处理分析图片。

1.3 统计学处理

统计分析及制图采用SPSS 17.0、Image J、photoshop CS 5、Excel 2003软件完成，方差分析、t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的CoCl2对C6细胞增殖的影响

加入CoCl2后，50、100、200 μmol/L组的C6细胞的相对活性分别为（1.00±0.00）、（0.94±0.08）、（0.89±0.07）、（0.56±0.05）。50 μmol/L组和100 μmol/L组的C6细胞的相对活性与0 μmol/L组比较差异无统计学意义，200 μmol/L组的C6细胞的相对活性较0 μmol/L组差异有统计学意义（P＜0.05），C6细胞出现明显的增殖抑制，表现为细胞变细，突起减少，粘附性下降。

2.2 不同浓度的CoCl2对C6细胞HIF-1α的影响

CoCl2可引起HIF-1α表达增高，而且100 μmol/L组的HIF-1α的增高更显著，见图1。

图1 Western blotting检测不同浓度CoCl2对C6细胞HIF-1α表达的影响

2.3 常氧/缺氧条件下VEGF抗体对C6细胞增殖的影响

给予VEGF抗体后，无论是在常氧还是缺氧条件下，0.1 μg/mL组和1 μg/mL组C6细胞的相对活性与0 μg/mL组相比差异均无统计学意义（P＞0.05），10 μg/ mL组C6细胞的相对活性与0 μg/mL组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），细胞出现增殖抑制，见表1。

表1 常氧或缺氧情况下VEGF抗体对C6细胞增殖活性的影响（±s）

表1 常氧或缺氧情况下VEGF抗体对C6细胞增殖活性的影响（±s）

注：与0 μg/mL组比较，①P＜0.05

组别0 μg/mL组0.1 μg/mL组1 μg/mL组10 μg/mL组细胞相对活性常氧1.00±0.00 1.02±0.10 1.03±0.10 0.89±0.08①缺氧1.00±0.00 1.03±0.11 1.06±0.10 0.86±0.07①

2.4 常氧/缺氧条件下VEGF抗体对C6细胞迁移的影响

常氧和缺氧时，VEGF抗体的干预使C6细胞的迁移能力明显增强，与0 μg/mL组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）；0 μg/mL组缺氧情况下的C6细胞迁移能力更强，较常氧情况差异有统计学意义（P＜0.05）；0.1、1 μg/mL组缺氧情况下的C6细胞具有更强的迁移能力，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2、表2。

表2 常氧或缺氧情况下VEGF抗体对C6细胞迁移的影响（±s）

表2 常氧或缺氧情况下VEGF抗体对C6细胞迁移的影响（±s）

注：与0 μg/mL组常氧比较，①P＜0.05；与0 μg/mL组缺氧比较，②P＜0.05；与0.1 μg/mL组常氧比较，③P＜0.05；与1 μg/mL组常氧比较，④P＜0.05

组别0 μg/mL组0.1 μg/mL组1 μg/mL组迁移细胞数常氧61.28±5.96 98.72±9.65①114.68±10.59①缺氧96.69±9.42①152.35±14.64②③162.85±15.36②④

图2 常氧或缺氧情况下的VEGF抗体对C6细胞迁移的影响（×200）

2.5 常氧/缺氧条件下VEGF抗体对C6细胞侵袭的影响

在常氧情况下，0.1 μg/mL组和1 μg/mL组的C6细胞的侵袭能力明显增强（P＜0.05）；0 μg/mL组的C6细胞在缺氧情况下较常氧更具有侵袭力（P＜0.05），0.1 μg/ mL组和1 μg/mL组的C6细胞的侵袭能力明显增强（P＜0.05），且强于常氧情况（P＜0.05），见图3、表3。

表3 常氧或缺氧情况下VEGF抗体对C6细胞侵袭的影响（±s）

表3 常氧或缺氧情况下VEGF抗体对C6细胞侵袭的影响（±s）

注：与0 μg/mL组常氧比较，①P＜0.05；与0 μg/mL组缺氧比较，②P＜0.05；与0.1 μg/mL组常氧比较，③P＜0.05；与1 μg/mL组常氧比较，④P＜0.05

组别0 μg/mL组0.1 μg/mL组1 μg/mL组迁移细胞数常氧48.28±4.54 98.45±8.69①102.46±9.65①缺氧69.35±6.24①181.59±16.32②③205.68±18.96②④

图3 常氧/缺氧情况下的VEGF抗体对C6细胞侵袭的影响（× 200）

2.6 常氧/缺氧条件下VEGF抗体对C6细胞FAK、Pyk2磷酸化的影响

在常氧和缺氧情况下，0.1 μg/mL组的FAK总蛋白表达无变化，1 μg/mL组的FAK总蛋白表达下降（P＜0.05）；此外，单纯的缺氧处理未能使FAK总蛋白表达改变，而在缺氧情况下，1 μg/mL组的C6细胞的FAK总蛋白表达较常氧情况增高（P＜0.05）；缺氧和VEGF抗体的干预均未使得FAK-Tyr397自身磷酸化水平发生改变。在常氧及缺氧情况下，不同浓度VEGF抗体处理后，Pyk2总蛋白的表达差异无统计学意义；在常氧情况下，不同浓度VEGF抗体处理未引起Pyk2-Tyr402磷酸化水平改变；而在缺氧环境下，0.1 μg/mL组和1 μg/ mL组的C6细胞的Pyk2-Tyr402磷酸化水平明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4、表4。

3 讨论

在正常情况下，细胞内的HIF-α极不稳定，数分钟之内就会被泛素蛋白酶体（ubiquitin-proteasome path-way）降解，而在缺氧环境下，HIF-1α会转移至细胞核，与HIF-1β亚单位结合，参与相应基因的转录调控。在各种模拟细胞缺氧的实验方法之中，CoCl2模拟缺氧环境应用得较为广泛。CoCl2可抑制HIF-1α在细胞质的降解，导致HIF-1α堆积，继而模拟缺氧环境。由于Co-Cl2对细胞有一定的毒性作用，本研究评估CoCl2对C6胶质瘤细胞的影响。MTT实验结果显示，当CoCl2作用浓度波动于100 μmol/L以下时，C6细胞未出现明显的增殖抑制；当CoCl2作用浓度达到200 μmol/L时，C6细胞的相对活性明显下降，出现增殖抑制，与之前的报道基本吻合[9,10]。Western blotting结果示，正常细胞的细胞质内含有一定量的HIF-1α；以50 μmol/L的CoCl2处理C6细胞时，HIF-1α的含量增加；CoCl2达100 μmol/ L时，HIF-1α的含量更高。结合既往研究[10]，本研究认为100 μmol/L的CoCl2处理细胞12～24 h后，会引起HIF-1α过度表达，较适合用于模拟体外缺氧。因此，后续试验中采取100 μmol/L的CoCl2处理C6细胞模拟缺氧环境。

表4 常氧/缺氧条件下VEGF抗体对C6细胞FAK、Pyk2磷酸化的影响（±s）

表4 常氧/缺氧条件下VEGF抗体对C6细胞FAK、Pyk2磷酸化的影响（±s）

注：与0 μg/mL组常氧比较，①P＜0.05；与0 μg/mL组缺氧比较，②P＜0.05；与1 μg/mL组常氧比较，③P＜0.05

组别0 μg/mL组0.1 μg/mL组1 μg/mL组FAK蛋白常氧0.92±0.08 0.83±0.06 0.34±0.02①缺氧1.22±0.10 1.24±0.11 0.96±0.08②③FAK磷酸化常氧0.96±0.09 0.91±0.08 0.99±0.08缺氧0.89±0.08 0.90±0.09 0.92±0.08 Pyk2蛋白常氧0.45±0.04 0.47±0.03 0.46±0.04缺氧0.43±0.04 0.46±0.03 0.44±0.04 Pyk2磷酸化常氧1.26±0.12 1.42±0.14 1.51±0.15缺氧1.46±0.14 1.96±0.18 1.98±0.19①③

图4 Western blotting检测常氧或缺氧情况下VEGF抗体对C6细胞FAK和Pyk2总蛋白及其磷酸化水平的影响

既往研究[11]已证实，VEGF/VEGFR-2信号通路的激活可趋化内皮细胞增殖。传统观点认为，VEGFR-2仅存在于血管内皮细胞中。现有的研究[12]则对这一观点提出质疑，认为胶质瘤细胞中也存在VEGFR-2，胶质瘤细胞所分泌的VEGF不仅结合内皮细胞的VEGFR-2，而且也以自分泌的方式，结合肿瘤细胞自身的VEGFR-2，这被认为与胶质瘤的治疗抵抗密切相关。Knizetova等[13]运用VEGFR-2抑制剂（SU1498）阻断星形细胞瘤的这一自分泌信号通路，抑制星形细胞瘤的生长，且增强肿瘤细胞对电离辐射的敏感性，认为c-Raf/MAPK、PI3K/Akt和PLC/PKC均参与调控这一通路的激活。既往研究表明[14,15]，FAK/Pyk2与胶质瘤的迁移、侵袭行为密切相关。其中，FAK涉及细胞周期和细胞生存的调节，FAK激活后以促进胶质瘤细胞的增殖为主，在敲除Pyk2的细胞中FAK激活并不能促进细胞迁移，反而对细胞迁移具有一定的抑制作用；Pyk2激活以促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭为主，对胶质瘤细胞的增殖有负向调节作用；FAK和Pyk2之间的平衡是胶质瘤细胞增殖和迁移的重要调节因素。

综上所述，本研究发现100 μmol/L的CoCl2在12 h内造成C6胶质瘤细胞HIF-1α的堆积，且未造成细胞毒性，因此可用于模拟C6细胞的体外缺氧。在常氧及缺氧情况下，VEGF抗体未对C6细胞的增殖活性造成影响，但可增强C6细胞的侵袭迁移能力。在常氧及缺氧情况下，VEGF抗体未通过改变FAK-Tyr397位点的磷酸化水平来影响C6细胞的增殖活性。胶质瘤细胞的侵袭迁移能力变化是由多个因素调控的病理生理过程，在常氧情况下，VEGF抗体未改变C6细胞Pyk2-Tyr402位点的磷酸化水平。而在缺氧情况下，VEGF抗体的干预可使Pyk2-Tyr402位点的磷酸化水平增高，引起C6细胞的侵袭迁移能力进一步增强。

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（本文编辑：王晶）

Effect of VEGF Monoclonal Antibody on Proliferation,Invasion and Migration of C6 Glioma Cellsin vitro

LI Jun,YE Liang,WANG Fan.Department of Neurosurgery,Mianyang 404 Hospital,Sichuan 621000,China

Objective:To observe the effect of vascular endothelial growth factor(VEGF)monoclonal antibody on C6 glioma cells’proliferation,migration and invasionin vitro.Methods:CoCl2was added in culture medium to imitate hypoxic culture condition.C6 glioma cells were treated by VEGF antibody with different concentrations(0.1 μg/mL and 1 μg/mL)under normoxic or hypoxic conditions.Cell proliferation was detected by MTT assay.The ability of cell migration and invasion were evaluated by Transwell testing assay.The expression of HIF-1α protein,FAK/Pyk2 total protein and level of FAK-Tyr397/Pyk2-Tyr402 phosphorylation were detected by Western blot.Results:Treatment with 200 μmol/L CoCl2significantly inhibited the proliferation of C6 glioma cells(P＜0.05).10 μg/mL VEGF antibody significantly inhibited the proliferation of C6 glioma cells(P＜0.05).Compared to the normoxic condition,hypoxiia increased the migration and invasion of C6 cells(P＜0.05). Under the normoxic and hypoxic condition,the VEGF antibody can increase the migration and invasion of C6 (P＜0.05).Compared to the normoxic condition,hypoxia can enhance the migration and invasion by VEGF antibody to C6 cell(P＜0.05).The expression of total FAK protein was decreased in C6 cells by VEGF antibody only in the 1μg/ml concentration(P＜0.05).Under hypoxic condition,the phosphorylation levels of Pyk2-Tyr402 was increased in C6 cells after VEGF antibody treatment(P＜0.05).Conclusion:Under hypoxic condition,VEGF antibody can increase the phosphorylation levels of Pyk2-Tyr402,which contribute to the invasion and migration of C6 cells.

glioblastoma;migration;invasion;hypoxic;vascular endothelial growth factor(VEGF)

R741;R741.02

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.01.002

绵阳市404医院神经外科四川绵阳621000

中华医学会临床医学科研专项资金（No.12020600360）

2015-11-13

李俊gdhuanghb@163. com