蜡样芽胞杆菌对马铃薯茎秆降解试验研究

王建凤 徐粲然 田沛雨 杨 宁 李永国

（1.枣庄市山亭区农业技术推广中心 山东枣庄277200；2.清华大学化学工程系 北京100084；3.枣庄市山亭区绿色生态服务发展中心 山东枣庄277200；4.枣庄市农业农机技术推广中心 山东枣庄277800）

枣庄市位于山东省南部，属于温带大陆性季风气候，有利于马铃薯春秋两茬栽培，常年种植面积稳定在80余万亩，主要分布在滕州市界河镇、山亭区城头镇、薛城区周营镇、峄城区阴平镇、台儿庄区泥沟镇，农户种植经济效益显著。近年来，枣庄市大力开展国家可持续试验示范区创建，实行农业减肥行动，马铃薯作为枣庄市重要的粮蔬饲作物，绿色高效栽培技术不断被农民接受、推广、应用。但是，马铃薯收获后的茎秆成为污染环境、浪费资源的一个难题，不符合我国农业可持续发展的要求。鉴于此，笔者通过土壤环流驯化装置，从马铃薯种植土壤中筛选与强化，得到对马铃薯茎秆具有快速降解作用的土著微生物菌株，实现马铃薯茎秆的快速腐熟，达到马铃薯茎秆资源化利用，为相同生态种植区马铃薯茎秆利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

天平用于精确称量各类试剂及药品；培养箱主要用于实验室微生物的培养，为微生物的生长提供一个适宜的环境；循环流化床用于筛选菌株；高压蒸汽灭菌锅在进行无菌操作前需要将操作器皿、培养基等进行灭菌后才能使用，确保达到无菌；培养皿用于放置培养基，培养微生物，为微生物的繁殖提供营养物质；超净工作台实现微生物的接种及处理时的无菌操作。

1.2 微生物培养基配制

一是配制无机盐培养基。称量硫酸铵1.0 g、磷酸氢二钾0.5 g、磷酸二氢钾0.5 g、硫酸镁0.2 g，溶解于1000 mL去离子水中，在121℃环境中灭菌15 min。二是配制LB液体培养基。称量酵母粉0.5 g、氯化钠1.0 g、蛋白胨1.0 g，溶解于100 mL去离子水，在121℃环境中灭菌15 min。三是配制PDA液体培养基。称量马铃薯浸出粉0.3 g、葡萄糖2.0 g，溶解于100 mL去离子水，在121℃环境中灭菌15 min。

1.3 菌株筛选

2018年11 月，室外采集的土壤样品，通过土壤环流驯化法对所需功能微生物进行筛选。称取200 g土壤与10 g马铃薯茎段放入循环流化床内，底部放入4层纱布。将1500 mL经过121℃灭菌15 min的无机盐液体培养基随蠕动泵抽入流化床，蠕动泵转速为170 r/min，气泵排气量为2 L/min，每隔一段时间向流化床中补给培养基溶液。每隔2 d取环流液100μL，取得样品分别稀释102、104、106、108倍，各取100μL分别涂布在LB与PDA固体培养基上，放置在30℃恒温箱中培养。

从混合菌株中挑取的单一菌落，进行划线分离提纯，经过多次分离纯化后得到单一菌株，剔除生长较慢且易染菌的菌株后，总共筛选得到6个菌株，其中4株细菌、2株真菌（图1）。

图1 分离纯化后的菌株

2 试验验证与菌种鉴定

2.1 试验验证

2019年5 月，选取腐烂程度较低的马铃薯茎，切成2.5 cm左右的小段（叶基本腐烂，未加入），放入装有土壤的50 mL三角瓶中，同时加入2 mL菌液，用土覆盖，每个试验组3次重复，不加菌的作为空白对照组。定期补充水分，以维持土壤湿度。7 d后挖出马铃薯茎观察腐熟程度。

图2（a）为未降解的马铃薯茎段，呈鲜绿色，木质素外壳与内部纤维素连接紧密。7 d后将空白对照组和分别加入6株供试菌株的试验组中的马铃薯茎挖出，用清水冲洗干净，观察马铃薯茎的降解效果。由图2（b）可以看出，细菌对马铃薯茎的腐熟效果较好，真菌P-5和P-6与空白组CK无明显差别，均只腐熟了一部分马铃薯茎内部的纤维素。各菌株对马铃薯茎的腐熟程度由高到低依次为：P-2>P-1>P-4>P-3≈P-5≈P-6≈CK。其中，菌株P-2对马铃薯茎秆的降解效果最好，马铃薯茎的内部纤维素被完全降解，只剩余部分木质素外壳。

2.2 菌种鉴定

对上述所筛选并分离纯化的菌株进行了DNA测序，菌株P-2为一株蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。蜡样芽胞杆菌广泛存在于空气、尘埃、土壤、水及植物和腐败有机物上，能产生抗逆性内生芽孢，是土壤中的优势菌，有利于促进植物根际生长、提高作物抗病能力等，属于目前研究比较多的植物根际促生菌。

3 结论与讨论

3.1 结论

从马铃薯种植地块中筛选到一株蜡样芽胞杆菌的降解菌，该菌株对马铃薯茎秆的降解效果较好，7 d后马铃薯茎的内部纤维素被完全降解，只剩余部分木质素外壳，该菌株的筛选为马铃薯茎秆腐熟还田技术的研究奠定了基础。

3.2 讨论

3.2.1 为马铃薯秸秆综合利用提供有效支撑 马铃薯茎秆腐熟还田技术能够推动秸秆资源循环利用和多种生产要素的有效转化，大大加速秸秆的腐烂分解，提高农作物秸秆资源化利用效率，推动马铃薯茎秆肥料化利用，作为一个主导的方向，实现农业的循环发展。

3.2.2 实现农业的资源化利用 马铃薯茎秆腐熟还田技术可以增加土壤中有机质的含量，改善土壤的理化性质，形成更加合理的团粒结构，调节土壤的pH，增加土壤中有益微生物菌群的数量，增强土壤的蓄水保肥能力，减少化肥的使用量，形成更加健康的土壤，提高作物的产量和品质，实现农业绿色化与生态化。

3.2.3 有利于建设美丽宜居乡村 马铃薯茎秆腐熟还田技术还能够有效解决马铃薯茎秆乱堆放、随意焚烧问题，减少对大气、土壤、水等环境的污染，有利于马铃薯茎秆集中处理，为乡村环境整治节约资金开支，有利于构建更加美丽宜居的新乡村。

3.2.4 创新马铃薯茎秆多元开发方式 蜡样芽胞杆菌作为马铃薯茎秆分解腐熟还田的一种微生物，对于微生物菌群的识别需要进一步扩大试验研究，在大田中开展规模更大的试验研究，得到更具说服力的结论，同时开展菌株的筛选研究，获取更多种有益微生物菌群；在马铃薯茎秆的利用方面，马铃薯茎秆分解腐熟还田作为一种方式，需要肥料化、饲料化等更多利用方式的结合，最终达到综合高效的利用效果。

3.2.5 做好茎秆还田配套技术措施 在马铃薯茎秆腐熟还田过程中，茎秆腐熟要充分、彻底，保证能够彻底杀灭病菌，防止肥料带菌带毒入地。如开展马铃薯茎秆直接还田，需要做好相关的配套技术措施，增施微生物菌剂，调理土壤杀灭病菌，增加土壤中微生物菌群的数量，提高作物的产量与品质。