板栗红粉病病原菌鉴定及其生物学特性研究

张娜娜, 李双民, 温晓蕾, 冯丽娜, 王俊凤, 杨文杰, 霍佳欢, 兰淑慧, 孙伟明*, 齐慧霞*

(1.河北科技师范学院农学与生物科技学院, 河北 秦皇岛 066600; 2.河北省昌黎县职业技术教育中心， 河北 秦皇岛 066600; 3.河北农业大学植物保护学院, 河北 保定 071002)

中国是板栗生产大国，种植栽培面积和产量均居世界前列[1]。近年来，随着板栗产业迅速发展，栽培面积不断扩大，病害发生逐年加重。板栗在贮藏期由于果实呼吸旺盛，极易受微生物侵染而腐烂变质。板栗贮藏期腐烂主要由多种真菌复合侵染造成，梁丽松等[2]对北京、山东、湖南等地板栗果实腐烂病共鉴定出11个病原菌属，分别是大茎点属(Macrophomasp.)、镰孢菌属(Fusariumsp.)、拟茎点霉属(Phomopsissp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsissp.)、刺盘孢属(Colletotrichumsp.)、茎点霉属(Phomasp.)、小穴壳属(Dothiorellasp.)、毛霉属(Mucorsp.)、链格孢属(Alternariasp.)、丝核菌属(Rhizoctoniasp.)、青霉菌属(Penicilliumsp.)。吴光金等[3]在腐烂栗果上检测到13个真菌属，1个细菌属，认为泡囊假单胞杆菌(PseudomonasvesicularisGalarneaultetLeifson)和多主小穴壳菌(DothiorellaribisGrossetDuggur)是主要的致腐菌。贮藏期红粉病是由粉红单端孢菌(Trichotheciumroseum)引起的，主要危害板栗栗果，发病初期形成褐色病斑，并在病斑处附着白色粉状物，随后病斑缓慢扩展，可蔓延整个果面，后期在病斑处着生大量粉色霉层，发病果仁失水变僵、变苦，并能产生毒素。目前，对于红粉病的研究集中在菜豆红粉病[4]、芒果果腐病[5]、苹果霉心病[6]、甜瓜粉霉病[7]、龙眼红粉病[8]、枣红粉病[9]、番茄红粉病[13]、棉铃红粉病[14]、黄瓜红粉病[15]等，对板栗的研究较少。本文对板栗红粉病病原菌进行了分离纯化，采用形态学及分子生物学方法进行了病原鉴定，同时研究了该病原菌的生物学特性,旨在明确板栗红粉病的病原,了解其特性,明确其最适生长环境条件,为病害的识别和防控提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病果采集自河北省唐山市迁西市栗园，品种为早丰。

PDA培养基：水1 000 mL，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g。

1.2 病原菌的分离纯化

采用组织分离法[10]分离和纯化病原菌，从栗果的病健交界处切取5 mm×5 mm的组织块，将组织块用75%乙醇表面消毒30 s,无菌水冲洗3次，最后用灭菌滤纸吸干表面水分，接种至PDA培养基上，每皿3块，25 ℃恒温箱(ZGZ-450，上海丙林电子科技有限公司)中倒置培养5 d，待菌落长出后挑取菌落边缘处，接种到新的PDA培养基中培养纯化，纯化后转入斜面试管4 ℃条件下保存备用。

1.3 病原菌的形态学鉴定

将供试菌株接种到PDA培养基上，于25 ℃恒温培养10 d，观察病原菌在培养基上的菌落形态，从菌落表面挑取培养物，蔡司显微镜(Primo Star)观察菌丝形态及孢子情况，测量孢子大小，进行形态学鉴定[10-11]，初步确定病原菌分类地位。

1.4 致病性鉴定

根据柯赫氏法则[10]，采用离体接种法检测病原菌的致病性。选取健康板栗栗果，75%乙醇表面消毒后用无菌水冲洗2遍，用针刺法在果仁接种部位制造伤口，取7 mm活化后的菌丝块接种于果仁的伤口部位，保鲜膜固定，以无菌水作为对照，置于培养皿(直径150 mm)中25 ℃条件下保湿培养，24 h后去掉菌饼，记录发病情况，分离发病栗果病原菌，与原接种菌进行比较。

1.5 病原菌的分子鉴定

从培养5 d的菌株上挑取适量菌丝，放入1.5 mL灭菌离心管里，用研磨机将其磨碎，利用DNA基因组试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)提取DNA。对病原菌进行ITS序列扩增，所用引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[12]。PCR反应总体积25 mL，包含上下引物各1 mL，DNA模板2 mL，ddH2O 12.5 mL，2×EsTaqMasterMix 8.5 mL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 32个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，合格样品送往生工(上海)公司测序。将测序所得菌株DNA-ITS序列与NCBI中ITS区相关序列比较同源性，用MEGA-X软件采用邻接法构建系统发育树。

1.6 病原菌的生物学特性研究

1.6.1培养基筛选 参照王勇等[13]和潘月敏等[14]方法筛选培养基：将直径为0.7 cm的病原菌菌饼分别放入番茄培养基、燕麦培养基、板栗培养基、胡萝卜培养基、绿豆培养基、玉米培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、马丁培养基、PSA培养基平板中央，每处理重复3次，25 ℃条件下恒温培养8 d，采用十字交叉法测量菌落的直径。

培养10 d后，在每个平板中加入10 mL的无菌水，制成孢子悬浮液，使用血球计数板在10×10倍的生物显微镜测定产孢量。

1.6.2碳源、氮源筛选 碳源：以PDA为基础培养基，分别用阿拉伯糖树胶粉、α-乳糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、D-木糖醇、葡萄糖、可溶性淀粉作为唯一碳源。

氮源：以PDA为基础培养基，添加硫酸铵、蛋白胨、氯化铵、硝酸钠、酵母膏、牛肉膏、硝酸钾作为氮源。

病原菌菌丝生长和产孢的测定方法同1.6.1。

1.6.3pH筛选 用0.1%的NaOH和HCl溶液调节PDA培养基，使其pH为5、6、7、8、9、10、11、12。打取0.7 cm病原菌菌饼放在培养基平板的中央，3次重复，25 ℃条件下恒温培养，病原菌菌丝生长和产孢的测定方法同1.6.1。

1.6.4温度筛选 打取0.7 cm病原菌菌饼放入PDA培养基平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃进行培养，3次重复，病原菌菌丝生长和产孢的测定方法同1.6.1。

1.6.5光照筛选 打取0.7 cm病原菌菌饼置于PDA培养基平板的中央，将光照条件设为24 h光照、12 h光暗交替、24 h黑暗，25 ℃条件下恒温培养，3次重复，病原菌菌丝生长和产孢的测定方法同1.6.1。

1.7 数据分析

试验数据用DPS 2005和SigmaPlot 12.5软件分析和处理。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的菌落及形态特征

病原菌在PDA培养基上培养8 d，菌落直径为6.78 cm。PDA培养基上病原菌菌落圆形或近圆形、粉状、边缘整齐，具有同心轮纹，生长初期菌丝为白色，后期菌落中央橘粉色，边缘浅白色(图1)，分生孢子梗形态直立或弯曲状态、褐色，具有分支，分生孢子着生于分生孢子梗顶端，分生孢子无色透明、单胞、梨形、表面光滑，有横膈膜0～1个，不具有纵膈膜，隔膜处缢缩(图1)，分生孢子大小为5.465 mm×13.526 mm～11.504 mm×20.531 mm。经形态学鉴定,该病原初步确定为粉红单端孢菌(Trichotheciumroseum)。

2.2 致病性鉴定

板栗离体果仁经刺伤接种3 d后开始发病，症状初期在伤口部位可见明显的黑褐色病斑，病斑处着生白色霉层，随后病斑缓慢向周围扩展,接种10 d后病斑处着生大量橘粉色霉层，无菌水对照处理未发病(图2)，根据柯赫氏法则，该病原菌能从接种发病的果仁上重新分离，得到与最初分离并用于接种的病原菌形态特征一致，说明分离的病原菌为引起板栗红粉病的致病病原菌。

2.3 病原菌分子鉴定

经测序，病原菌rDNA-ITS序列片段大小为613 bp,将所得rDNA-ITS序列在NCBI数据库中进行blast比对，Blast比对结果显示，该病原菌的rDNA-ITS序列与粉红单端孢菌(Trichotheciumroseum.MN882763)的序列相似性为100%，聚为一个分支，能够与其他的种类分开，结合形态学特征及分子生物学技术鉴定结果，确定造成板栗红粉病的致病原菌为粉红单端孢菌(Trichotheciumroseum)。

2.4 病原菌的生物学特性分析

2.4.1培养基对病原菌的影响 病原菌在不同培养基上生长及产孢情况如图4所示：该病原菌在PDA、牛肉膏蛋白胨培养基上生长最好，8 d后菌落直径分别为6.78和6.67 cm，产孢量分别为1.52×107和2.02×107cell·L-1，其次为绿豆、板栗培养基，燕麦培养基最不适合该病原菌的生长及产孢，其菌落直径为2.90 cm，产孢量为0.20×107cell·L-1。

2.4.2碳源和氮源对病原菌的影响 病原菌对不同碳源的利用如图5所示：病原菌在不同碳、氮源上均能生长，其中对碳源阿拉伯树胶粉、可溶性淀粉利用最好，适合菌丝生长，8 d后菌落直径分别为6.25和5.80 cm，但阿拉伯树胶粉不利于病原菌的产孢，仅为0.58×107cell·L-1，对α-乳糖的利用较低，但其利于病原菌的产孢，达到3.05×107cell·L-1。

氮源蛋白胨、牛肉膏适合菌丝的生长(图6)，8 d菌落直径分别为6.33和5.83 cm，并且蛋白胨也利于该病原菌的产孢，产孢量为1.73×107cell·L-1，硝酸钠不利于菌丝的生长，菌落直径为4.72 cm，硫酸铵不利于产孢，产孢量仅为0.48×107cell·L-1。

2.4.3pH对病原菌的影响 由图7可知，该病原菌在pH 5～12的范围内均能生长，其中在pH 8的条件下菌丝生长较快，菌落直径为6.73 cm，在pH 12时菌丝生长最慢，菌落的直径为3.25 cm，说明该病原菌菌丝不适合在强碱的环境条件下生存，在pH 7时产孢数量最多，数量为1.13×107cell·L-1，pH 5时产孢数量最少，pH 10与pH 9处理之间差异不显著，pH 7与pH 5之间差异不显著。

2.4.4温度对病原菌生长和产孢的影响 温度对病原菌影响较大(图8)，在10～30 ℃时，可以正常生长，当低温5 ℃、高温35 ℃时，该病原菌停止生长及产孢，当培养温度为25 ℃时，最适合菌丝生长及产孢，菌落直径为6.78 cm，产孢量为1.55×107cell·L-1；20 、15 ℃时生长次之，而温度为30 、10 ℃时菌丝生长较慢，不利于其产孢。

2.4.5光照对病原菌生长和产孢的影响 病原菌的生长及产孢对光照有一定要求(表1)，12 h光暗交替最适合菌丝的生长及产孢，菌落直径为6.78 cm，产孢量为1.55×107cell·L-1；24 h光照有利于菌丝生长但不利于病原菌的产孢；无光照条件时，菌丝生长缓慢，菌落直径为4.35 cm。

表1 光照对病原菌生长的影响Table 1 Effects of light on growth of pathogen

3 讨论

本研究结合形态学特征、致病性及ITS基因序列，明确了引起板栗红粉病的致病原菌为粉红单端孢菌(Trichotheciumroseum)，该菌属半知菌亚门真菌[15]，发病初期形成褐色病斑，病斑可蔓延整个果面，后期在病斑处着生大量粉色霉层。本研究对其病原菌进行系统研究，生物学特性研究结果表明,该病原菌菌丝在10～30 ℃范围内均能生长,但在低温下菌丝生长缓慢,5 ℃停止生长,适宜生长温度为25 ℃；pH 5～12环境中菌丝均能生长,pH 8最适生长，在pH 7时产孢数量最多；在供试的碳氮源中,以阿拉伯树胶粉有利于菌丝的生长，α-乳糖有利其产孢；在氮源蛋白胨上均利于其产孢和菌丝的生长；光暗交替有利于菌丝的生长和孢子的形成；在牛肉膏蛋白胨上均利于菌丝的生长与孢子的形成。刘文钰等[16]报道的结果显示，菌丝生长最适合的氮源是蛋白胨，25 ℃时菌丝生长最旺盛，12 h光暗交替时菌丝生长最好，与本研究结果相一致。焦瑞莲等[17]研究显示，T.roseum菌丝在5和40 ℃不再生长，菌丝生长的最适温度为25 ℃，以25 ℃条件下产孢最多，与本文的研究结果基本相一致。王勇等[13]研究结果表明，在pH 6时最适宜菌丝的生长，pH 5时适宜产孢，与本文研究结果不一致，可能是由于不同的地域导致两者之间的生物学特性存在一定差异。本研究为冀东地区板栗红粉病的针对性防治提供了理论依据，而该病原菌对不同板栗品种的致病性、侵染特性以及防控等方面还需进一步研究探讨。