不同基因型小麦苗期耐低氮性评价及筛选

李俊杰, 杜蒲芳, 石婷瑞, 侯沛佳, 柴新宇, 赵瑞, 汪妤, 李红霞

(西北农林科技大学农学院， 陕西 杨凌 712100)

氮素是作物生长过程中必需的营养元素之一，对其生长发育和产量形成具有重要作用。随着农业生产的发展，化肥使用量逐年增加，我国化肥施用量占世界总量的1/3，且年均增长速度达4%，但氮肥利用效率远远低于世界平均水平[1-2]。为了追求产量而过量施肥，降低氮肥利用效率的同时也造成了环境污染[3-5]，因此，挖掘作物氮利用潜力可以减少化肥的使用，降低生产成本。评价和筛选小麦耐低氮种质资源，通过遗传改良培育氮高效品种，是保障我国小麦产业可持续绿色发展的有效途径。

选择合适的氮效率相关指标进行耐低氮性鉴定是作物氮高效育种的前提。在水稻(OryzasativaL.)[6-7]、玉米(ZeamaysL.)[8]、棉花(GossypiumhirsutumL.)[9-10]、谷子(Setariaitalica)[11-13]和大麦(HordeumvulgareL.)[14]等作物中已经进行了耐低氮性研究。目前耐低氮性评价多基于农艺性状表型，翟荣荣等[15]利用4个苗期性状(根干重、根冠比、根尖数和苗干重)和2个生育后期性状(有效穗数和单株产量)作为指标筛选氮高效粳稻品种。李强等[16]选取叶面积、根冠比、根干重和氮积累量等7个评价指标，对51个玉米杂交种进行苗期低氮胁迫筛选。连盈等[17]利用苗根长、根冠比和氮素生理效率等指标，对45份谷子品种进行耐低氮性评价。姜琪等[18]对19份大麦品种的耐低氮性进行筛选和鉴定，获得5份耐低氮大麦品种。作物种类不同，筛选压力的选择也不相同，已报道的氮胁迫浓度为0.10、0.25、0.30、0.50和0.60 mmol·L-1等[19-21]。目前关于小麦耐低氮品种的筛选相对较少，大量研究表明，不同小麦品种对氮素的吸收利用能力不同[22-23]。徐晴等[24]研究认为，在低氮条件下小麦产量主要由氮素的吸收效率决定。小麦氮素的高效吸收与根系形态和生物量密切相关[25]，因此，通过苗期形态学指标进行小麦耐低氮性评价对小麦氮高效利用品种的筛选具有重要的指导意义。本研究前期征集到118份小麦种质资源，利用苗期水培的方法，设置低氮胁迫和正常氮两个处理，分析氮素对小麦幼苗生长发育性状(根干重、茎叶干重和根冠比)以及根系形态指标(最大根长、初生根数和二级初生根数)的影响，筛选不同耐低氮性小麦基因型。旨在为小麦耐低氮育种提供材料基础，为小麦耐低氮胁迫生理机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

118份小麦种质资源来自全国各小麦生态区，其中山东48份、河南35份、河北25份、陕西5份、北京3份、安徽和江苏各1份,均由中国农业大学农业生物技术国家重点实验室彭慧茹教授提供，编号和品种名称见表1。

表1 供试小麦材料Table 1 Wheat materials tested in this experiment

1.2 试验设计

试验于2019年4月在西北农林科技大学南校区温室进行。采用裂区设计,主区为氮水平, 设置正常氮(N浓度为5 mmol·L-1)和低氮胁迫(N浓度为0.1 mmol·L-1)2个处理，以NH4NO3形态供应。副区为118个不同基因型小麦品种(系)。其余营养配方为: KCl 1.8 mmol·L-1、CaCl21.5 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 mmol·L-1、KH2PO40.2 mmol·L-1，微量元素和铁盐同Hogland营养液。

选取籽粒饱满、大小均一的小麦种子，用1% NaClO溶液消毒,蒸馏水漂洗3遍，避光培养至露白。先挑选萌发一致的种子腹沟朝下摆放在铺有滤纸的培养皿中，放置在人工气候箱(温度20 ℃，光照16 h/黑暗8 h，相对湿度65%)培养至幼苗5 cm左右，然后选取生长健壮的幼苗移栽到Hoagland营养液中培养至两叶完全展开。每个基因型小麦选取5株进行正常供氮和低氮胁迫处理4周，每3 d更换1次营养液，期间用电动气泵连续通气，每个处理重复3次。

1.3 性状调查与指标测定

用去离子水漂洗小麦幼苗根部3遍，使用LA-S根系扫描仪(万深公司，中国)采集图片，然后用Imagej软件处理图片计算最大根长(max root length，MRL)、初生根数(primary root number，PRN)和二级初生根数(secondary primary root number, SPRN)。用吸水纸吸去残留水分, 将植株分为茎叶和根系两部分于105 ℃杀青30 min，80 ℃下烘至恒重后用万分之一天平称取根干重(root dry weight, RDW)和茎叶干重 (straw dry weight, SDW)。

1.4 指标计算与数据分析

根冠比(root/shoot ratio, RSR)=根系干重/茎叶干重

(1)

植株干重(plant dry weight, PDW)=茎叶干重+根干重

(2)

各性状指标的耐低氮系数PI=Xi/CKi

(3)

(4)

隶属函数U(Xi)=(PIi-PImin)/(PImax-PImin)

(5)

(6)

(7)

灰色关联系数L0ik=(Δmin+ρΔmax)/(Δ0ik+ρΔmax)

(8)

(9)

式中，Xi、CKi分别为低氮水平、正常氮水平下的性状测量值；PImin、PImax为各性状指标耐低氮系数的最小值、最大值；ri为各性状指标与综合耐低氮系数的相关系数，Wi为指数权重，表示第i个性状指标在所有指标中的重要程度;Δ0ik为k时刻两个序列的绝对差，Δmin和Δmax分别为所有比较序列各个时刻绝对差中的最小值与最大值，Δmin=0，分辨系数ρ=0.5。

运用Excel 2010和SPSS分析软件进行生物统计、方差分析、主成分分析、聚类分析及相关性分析，R语言的GGE-Bioplot软件包作GGE双标图。

2 结果与分析

2.1 两种氮水平下小麦苗期氮效率相关性状的基因型差异

由表2可以看出，供试材料在正常和低氮胁迫条件下性状的变异幅度都比较大，对照组的变异系数为17.50%～41.78%，低氮组的变异系数为17.67%～45.86%，变异系数越大，说明品种间差异越大。低氮胁迫下最大根长明显缩短，下降39.51%，茎叶干重降低25.64%。但根干重增加22.23%，根冠比增加64.35%，初生根数目增加14.14%。由此推断，低氮胁迫促进根系干物质量的积累，同时抑制地上部的干物质积累，造成根冠比升高。处理间对比发现，所有性状指标均达到极显著水平。结果表明，低氮处理效果良好，表型明显。供试材料的耐低氮相关性状指标具有丰富、广泛的遗传差异性，可以用于筛选小麦耐低氮品种。

表2 两种氮水平下小麦苗期的氮效率性状指标Table 2 Nitrogen efficiency indexes of wheat under two nitrogen levels at seedling stage

2.2 各性状指标耐低氮系数分析

2.2.1各性状指标耐低氮系数的区间分布 为减小品种间遗传及生物学差异造成的误差，采用耐低氮系数PI来表征性状对氮胁迫的敏感程度。将各性状指标的耐低氮系数以0.5为组距，分成6个区间，统计数值的分布频数情况。从表3可以看出，不同指标的耐低氮系数在同一区间或不同区间的分布频率和次数差别较大。其中，根干重耐低氮系数PI>1的品种占73.51%，说明大多数小麦根系的干物质量在低氮胁迫后增加，根干重对低氮胁迫响应明显。茎叶干重耐低氮系数0≤PI≤1区间的品种占90.68%，说明低氮胁迫致使大多数小麦苗期地上部的干物质积累受到抑制，干重降低。最大根长耐低氮系数0≤PI≤1区间的品种占91.52%，说明低氮胁迫会降低根系的初生根长度。结果表明，根干重、茎叶干重、根冠比、植株干重、最大根长、初生根数和二级初生根数等氮效率相关指标受低氮胁迫差异显著，可以用于鉴定小麦苗期的耐低氮性。

表3 小麦种质各性状指标耐低氮系数的区间分布Table 3 Interval distribution of low nitrogen tolerance coefficient of wheat germplasm

2.2.2各性状指标耐低氮系数的相关性分析

各性状指标耐低氮系数相关性分析显示(表4)，根干重与根冠比的相关性为0.855，茎叶重与植株干重的相关性为0.894。茎叶干重与最大根长和根冠比不相关。各性状指标的耐低氮系数与综合耐低氮系数均显著相关，其中根干重和根冠比与综合耐低氮系数相关性最大，分别为0.934和0.779。由此可见，综合耐低氮系数RI是衡量品种耐低氮性的重要指标之一。

表4 小麦苗期各性状指标耐低氮系数的相关性分析Table 4 Correlation analysis on low nitrogen tolerance coefficient of each trait of wheat seedlings

2.3 小麦苗期氮效率相关性状的主成分分析

对各性状指标的耐低氮系数进行主成分分析(表5)， 提取3个主成分，贡献率分别为 43.575%、22.904%和17.873%，累积贡献率达84.351%。第一主成分贡献率最大，主要由根干重、茎叶干重和植株干重决定，此主成分主要反映低氮胁迫下植株整体的适应性变化。第2主成分中根冠比的特征向量最大(0.801)，茎叶干重的特征向量最小(-0.590)，说明小麦通过减少茎叶干重来增加根冠比从而适应低氮环境。第3主成分中最大根长的特征向量最大(0.754)，初生根数目的特征向量最小(-0.645)，说明小麦通过增加初生根数目来降低最大根长，此主成分反映根的适应性变化。主成分分析可将多个相关变量转化为少数几个反映全部指标信息的综合变量，说明这3个主成分包含了参试品种苗期性状的大部分信息。

表5 小麦氮效率相关性状的主成分分析Table 5 Principal component analysis of nitrogen efficiency related wheat traits

以根干重、茎叶干重和植株干重为评价指标，采用隶属函数法计算两种氮处理下小麦种质的氮效率值，并作散点图(图1)。将不同种质分成4类:第Ⅰ类为双高效型(13个)，占11.02%，包括新麦16、新麦19、新麦20、温9629、太空6号、兰考679、洛麦21和花培1号等；第Ⅱ类为正常氮高效型(11个)，占9.32%，包括石麦22、石优17、刑531、邯生923、洛麦31、黄县大粒半芒、洛麦29和新麦12等；第Ⅲ类为双低效型(84个)，占71.19%，包括鲁麦22、济南16、神麦1号、济南矮6号、桓群4号、白高38和鲁腾1号等；第Ⅳ类为低氮高效型(10个)，占17.5%，包括山农0917、天民198、漯麦8号、金丰7183、石麦18、新麦208、华育198、鲁麦3号、汝0319和新麦21等。

2.4 不同小麦品种苗期耐低氮性的综合评价

利用性状指标的耐低氮系数，采用模糊隶属函数法计算出隶属函数值U(X)，得出各性状指标的权重分别为0.228、0.091、0.176、0.190、0.091、0.07和0.154。最后计算出每个小麦品种的耐低氮性综合评价值(D)，D值越大表明其耐低氮能力越强。以耐低氮性综合评价值D为评价指标，采用欧氏最长距离法对118份小麦品种进行聚类分析, 将其分为5个类群(图2)。第1类为氮敏感型(D≤0.152), 包括石新733、凫山半截芒、石H083-366、新麦20、鲁麦23、石优17、桓群4号、山农15、德选1号、石新633、新麦2111、良星77、衡10S29-2、石麦22、邯生923和鲁麦12 ，共16个品种，占13.79%；第2类为氮较敏感型(0.160≤D≤0.237), 包括刑531、白高38、黄县大粒半芒、洛麦29、兰考679、山农23、邢麦33、新麦19等63个品种,占总数的53.39%；第3类为中间型(0.242≤D≤0.365)，包括冀麦325、项麦969、华育198、新麦21、漯麦8号、新麦208、林麦4号、新麦13和平原50等34个品种,占28.81%;第4类为耐低氮型(0.422≤D≤0.465), 包括齐大195、金丰7183和天民198 3个品种，占2.54%；第5类为强耐低氮型，包括山农0917和鲁麦8号，占1.69%。

2.5 各性状与耐低氮性综合评价D值的相关性分析

2.5.1灰色关联度分析 灰色关联度分析(表6)显示，各性状指标与耐低氮性综合评价D值的关联度较高，最小值为0.908，最大值为0.963。关联程度由大到小依次为根干重>茎叶干重>最大根长>初生根数>二级初生根数。结果表明,与小麦品种苗期耐低氮性关系最密切的指标性状为干物质量指标(如根干重、茎叶干重)，其次是根的形态指标(如最大根长、初生根数和二级初生根数)。

表6 各性状指标耐低氮系数与综合评价D值 的灰色关联度分析Table 6 Grey relational analysis beween low nitrogen tolerance coefficient and comprehensive evaluation D value

2.5.2GGE双标图分析 利用GGE双标图对小麦品种耐低氮性综合评价D值与各性状指标耐低氮系数进行相关性分析，通过品种和耐低氮性状的相互关系对不同小麦品种的耐低氮性进行分组，并揭示组内耐低氮能力最强的品种。将同一方向上距离原点最远的品种连接构成多边形，多边形各边的垂线把双标图分成若干个扇形区，不同的小麦品种包括相关性状分布在不同的扇区内。每个扇区内“顶角”的品种为所包含性状表现最好的品种，位于多边形内部或者靠近原点的品种则为表现较差的品种。结果如图3所示，以耐低氮品种山农0917为代表的扇区内，包含天民198、鲁215953、项麦969和鲁麦3号等耐低氮性强的品种，耐低氮性状为根干重和最大根长。在耐低氮品种鲁麦8号为代表的扇区内，有金丰7183、齐大195、华育198和漯麦8号等耐低氮性强的品种，耐低氮性状为植株干重和二级初生根数目。以敏感型品种鲁麦12为代表的扇区内没有耐低氮性状。这说明不同基因型小麦氮素吸收利用效率存在差异，且耐低氮机制也不相同。

3 讨论

植物的根系特性与氮素的吸收、代谢最为密切。氮素首先经根系吸收，然后才能被同化和转运，所以根系形态和生理特性直接影响着植物对氮素的吸收[26]。根系的总干重、最大根长、初生根数目以及次生根数目都是反映根系吸收养分能力的重要指标[27]。裴雪霞等[28]选取了根干重、植株干重、株高、根冠比等形态指标对小麦苗期耐低氮性进行鉴定，筛选耐低氮品种。本研究选择根干重、茎叶干重、根冠比、植株干重、最大根长、初生根数和二级初生根数7项指标鉴定耐低氮性，全面反映了植株对低氮胁迫的响应。结果表明,在低氮胁迫下，大多数小麦品种的最大根长降低，根干重和根冠比增加，低氮胁迫明显抑制植株苗期地上部茎叶的干物质积累和根系的伸长，增加根系的干物质积累，这与前人研究结果基本一致。通过灰色关联分析发现，茎叶干重和根干重与小麦耐低氮性关系最密切。此外，各性状的变异系数均大于15%，低氮处理后品种间的变异系数增加，说明各指标对低氮胁迫敏感，可用于小麦苗期耐低氮性筛选。大多数研究表明，苗期根系的生理特性和茎叶的繁茂性对作物全生育期的氮素吸收至关重要[29]，而且小麦苗期的氮效率相关性状和成熟期的农艺性状间存在显著的相关关系[30]，因此该结果可以作为小麦氮效率筛选的重要参考。但是小麦的不同生长阶段对氮敏感程度不同，苗期是氮素营养敏感期，但是氮素最大利用效率期在拔节期之后，所以小麦氮高效材料筛选需要田间试验进一步佐证，将氮利用效率与产量联系起来才能真正筛选出氮高效利用种质资源。

本研究利用苗期水培的方法进行品种筛选，选取小麦幼苗的形态和生理性状为指标, 分别采用模糊隶属函数法和基于主成分的隶属函数分析法，对小麦耐低氮能力进行综合评价。基于模糊隶属函数法计算的耐低氮性综合评级D值将118份不同基因型小麦划分为5类。结果表明，山农0917和鲁麦8号为强耐低氮品种, 齐大195、金丰7183和天民198为耐低氮品种，可作为耐贫瘠品种种植在土壤缺氮地区。石麦22、邯生923和鲁麦12号等16份氮敏感型品种, 适合种植在土壤肥沃的地区。此外，本研究利用主成分分析确定根干重、茎叶干重和植株干重为指标，基于隶属函数的氮效率值将不同小麦种质分为双高效型、正常氮高效型、低氮高效型和双低效型4种类型，结果发现与耐低氮性综合评级D值筛选结果高度一致，均筛选出耐低氮较强的品种山农0917、天民198、金丰7183。两种评价方法充分证明了筛选结果的可靠性。另外,双标图分析显示山农0917、天民198的耐低氮性状为根干重和最大根长，金丰7183的耐低氮性状为植株干重和二级初生根数目，结果说明不同小麦品种的根系耐低氮生理机制不同。