种植密度对转Bt棉纤维杀虫蛋白表达量及氮代谢的影响

陈媛, 刘震宇, 周明园, 张晨霞, 田巧凤, 张中宁, 张祥, 陈德华

(扬州大学江苏省作物遗传生理国家重点实验室， 粮食作物现代产业技术协同创新中心, 江苏 扬州 225009)

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)转基因棉花自20世纪90年代中期首次商业化推广以来，已在世界范围内广泛种植。Bt棉的应用减少了化学药品的使用，从而减轻了环境污染，提高了安全性，同时杀虫剂和农药的减少降低了种植者的生产成本[1]。然而，在世界各地的棉花产区，Bt棉抗虫性会表现出下降或不稳定的情况[2]。研究表明，Bt棉杀虫蛋白的表达存在时空分布差异。在时间上表现为随生育进程表达量逐渐下降，即苗期抗虫性强，铃期抗虫性弱；对第2代棉铃虫抗性较高，但对第3、第4代棉铃虫的抗性显著下降[3]。在空间上表现为不同部位、不同器官的抗虫性存在差异，其中最重要的表现特征为生殖器官的抗虫性明显低于叶片[2]。除时空差异特征外，多种环境因素对Bt棉Bt蛋白的表达量均有影响。土壤干旱和涝渍显著降低棉株各器官的Bt蛋白表达量，其中又以干旱对Bt蛋白表达量的影响更大[4-7]。土壤盐分胁迫显著降低Bt蛋白表达量和Bt棉的抗虫性[8-10]。高温会使bt基因的沉默时间提前，Bt蛋白表达降低的时间也相应提前，导致Bt蛋白含量急剧降低[11-13]。空气湿度胁迫同样会导致Bt蛋白表达量急剧降低，并且会进一步加剧温度胁迫对Bt蛋白含量的影响[14-15]。因此，在Bt抗虫棉生产中如何协调好各方面因素，充分发挥其抗虫潜力，对提高棉花生产的总体效益具有重要意义。

种植密度作为一种易于调控的栽培措施，改变种植密度会直接影响到棉花的个体发育和群体构成，从而影响产量及其构成因素，如铃重和铃数等[16-18]。研究表明，种植密度对Bt 棉蕾中Bt蛋白的表达量具有显著影响，表现为在高密度下棉蕾中Bt蛋白表达量上升[19]。然而，种植密度对棉铃中Bt蛋白表达量的影响却鲜少报道。棉铃作为棉铃虫等相关害虫危害的首选对象之一，也是棉花栽培的产量对象，其Bt蛋白表达量的多少更能反映Bt棉抗虫性的强弱。因此，开展种植密度对棉铃抗虫性的研究，明确Bt棉抗虫性受密度的影响程度及其机理，从而解决Bt棉产量形成关键期对棉铃虫毒杀作用低，影响生殖器官发育的问题，对提高抗虫棉产量具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2015—2016年在扬州大学农学院试验田(N 32.39°，E 119.42°)进行，以具有相同遗传背景的Bt棉常规种泗抗1号(SK-1)和杂交种泗抗3号(SK-3)为试验材料。采用穴盘育苗移栽方式，分别于2015年4月6日播种，5月19日移栽大田；2016年4月9日播种，5月17日移栽大田。基施氮肥(60 kg·hm-2纯氮)、磷肥(300 kg·hm-2过磷酸钙)和钾肥(120 kg·hm-2KCl)；在初花期追施氮肥(54 kg·hm-2纯氮)、磷肥(300 kg·hm-2过磷酸钙)和钾肥(120 kg·hm-2KCl)；在成铃初期和盛铃期再次分别追施氮肥126和30 kg·hm-2(纯氮)。

设置1.5×104(D1)、3.0×104(D2)、4.5×104(D3)、6.0×104(D4)和7.5×104(D5)株·hm-2五个种植密度，单因素随机区组设计，重复3次。在开花时挂牌标记植株，分别于花后10 (10 DAF)、20(20 DAF)、30(30 DAF)和40(40 DAF) d，每小区取15个棉铃，其中10个用于测定棉铃干重和体积；5个经液氮冷冻后贮存于-80 ℃冰箱中，用于测定Bt蛋白及氮代谢物含量和相关酶活性。

1.2 测定项目与方法

每个小区选取10株棉株调查单株铃数，选取10个棉铃调查单铃体积及单铃干重。采用将棉铃浸入盛水的量筒，然后记录量筒水位上升的方法测定棉铃体积。将棉铃置于烘箱中110 ℃杀青30 min，然后80 ℃烘干至恒重，用USA HZ&HUAZHI电子天平(HZT-A+100)测定棉铃干重。

采用酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 测定Bt蛋白含量，试剂盒由中国农业大学提供，检测方法见Chen等[20]。可溶性蛋白含量采用G-250考马斯亮蓝比色法[21]测定；游离氨基酸含量采用抗坏血酸茚三酮染色法[22]测定；鲜样经Tris-HCl缓冲液研磨离心后，采用赖氏比色法测定[23]谷氨酸丙酮酸转氨酶(glutamic-pyuvic transaminase,GPT)和谷氨酸草酰乙酸转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase,GOT)活性；采用福林-酚试剂法[24]以产生酪蛋白含量表示蛋白酶活性；运用氨基酸的茚三酮反应[24]以吸光率的的变化值测定肽酶活性。

1.3 数据处理与分析

采用 Microsoft Excel 2010 软件进行数据处理和作图，采用 SAS 9.4软件进行统计分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小显著差异法(LSD，P=0.05)比较不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同种植密度下棉铃的发育情况

SK-1和SK-3两个品种的单株铃数、单铃体积和干重均随生育进程呈上升趋势(表1)。随着棉株的生长发育，单株铃数、单铃体积和干重不断增加，同一密度下SK-1和SK-3在40 DAF的单株铃数、单铃体积、单铃干重与10 DAF均呈显著差异。然而，随种植密度的增加，SK-1和SK-3两个品种的单株铃数、单铃体积和干重在四个生育期均呈下降趋势。同一生育期不同种植密度间,D5密度的单株铃数、单铃干重与D1密度呈显著差异(表1)。由此可见,随着种植密度的加大，单

株铃数、单铃体积和干重逐渐减少;同一时期相同种植密度时两个品种间差异不显著。

2.2 不同种植密度条件下棉纤维Bt蛋白表达量的变化

SK-1和SK-3两个品种的纤维中Bt蛋白表达量随生育进程呈增加趋势(表2)。随着棉株的生长发育，纤维中Bt蛋白表达量不断增加，同一种植密度下SK-1在40 DAF的纤维中Bt蛋白表达量与10和20 DAF纤维中Bt蛋白表达量均呈显著差异。然而，随种植密度的增加，SK-1和SK-3两个品种的Bt蛋白表达量在四个生育期均呈上升趋势，同一生育期不同种植密度间D5密度的纤维中Bt蛋白表达量与D1密度呈显著差异(表2)，即随着种植密度的加大，纤维中Bt蛋白表达量逐渐增加。

表2 不同种植密度下纤维中Bt蛋白表达量Table 2 Expression levels of Bt protein in cotton fiber under different plant densities

2.3 不同密度条件下Bt棉纤维中氮代谢的变化

SK-1和SK-3两个品种的纤维中可溶性蛋白含量和游离氨基酸含量均随生育进程呈上升趋势(表3)。随着棉株的生长发育，纤维中可溶性蛋白含量和游离氨基酸含量不断增加，SK-1和SK-3在同一种植密度下40 DAF纤维中可溶性蛋白含量与30、20和10 DAF可溶性蛋白含量均呈现显著差异；40 DAF纤维中游离氨基酸含量与20、10 DAF游离氨基酸含量呈显著差异。然而，随种植密度的增加，SK-1和SK-3纤维中可溶性蛋白含量在四个生育期均呈上升趋势，纤维中游离氨基酸含量在四个生育期均呈下降趋势，SK-1和SK-3在同一生育期不同种植密度下，D5密度下棉纤维中可溶性蛋白含量与D3、D2和D1密度下棉纤维中可溶性蛋白含量差异显著；D1密度下SK-1纤维中游离氨基酸含量与D5密度下差异显著(表3)。随着种植密度的加大，纤维中可溶性蛋白含量逐渐增加，游离氨基酸含量逐渐减少。同一时期相同种植密度时两个品种间差异不显著。由此可见，适当提高种植密度有利于棉纤维中可溶性蛋白质的合成和积累，降低游离氨基酸含量。

表3 不同种植密度下棉纤维中可溶性蛋白含量和游离氨基酸含量Table 3 The contents of soluble protein and free amino acid content in cotton fiber under different plant densities

SK-1和SK-3纤维中GPT和GOT活性均随生育进程呈上升趋势(表4)，随着棉株的生长发育，纤维中GPT和GOT活性不断升高，SK-1和SK-3在同一种植密度下40 DAF纤维中GPT和GOT活性与10 DAF纤维中GPT和GOT活性均呈显著差异。然而，随种植密度的增加，SK-1和SK-3纤维中GPT和GOT活性在四个生育期均呈上升趋势。SK-1在同一生育期不同种植密度下，D5密度下纤维中GPT和GOT活性与D2和D1密度下纤维中GPT活性差异显著(表4)，随着种植密度的加大，纤维中GPT和GOT活性均逐渐升高。由此可见，密度显著影响纤维中GPT和GOT活性，适当提高棉花种植密度，可以提高纤维中GPT和GOT活性，有利于氨基酸与蛋白质的合成。

表4 不同种植密度下纤维中GPT和GOT活性Table 4 Activities of GPT and GOT in cotton fiber under different plant densities

SK-1和SK-3纤维中蛋白酶和肽酶活性均随生育进程呈上升趋势(表5)，随着棉株的生长发育，纤维中蛋白酶和肽酶活性不断升高。SK-1和SK-3在同一种植密度下，40 DAF纤维中的蛋白酶和肽酶活性与10 DAF纤维中蛋白酶和肽酶活性差异显著。然而，随种植密度的增加，SK-1和SK-3纤维中蛋白酶和肽酶活性在四个生育期均呈下降趋势。同一时期不同种植密度相比较，D1密度下纤维中蛋白酶和肽酶活性与D4和D5密度下纤维中蛋白酶和肽酶活性呈显著差异(表5)，随着种植密度的加大，纤维中蛋白酶和肽酶活性均逐渐降低。由此可见，高密度的种植方式降低了纤维中蛋白酶和肽酶活性，从而降低了蛋白质的分解能力，提高了蛋白质含量，进而增强了抗虫性。

表5 不同密度水平下纤维中蛋白酶和肽酶活性Table 5 Activities of protease and peptidase in cotton fiber under different plant densities

2.4 棉铃Bt蛋白表达量与棉铃生长系数、氮代谢的关系

棉纤维Bt蛋白表达量与棉铃生长系数的相关分析表明(表6)，纤维中Bt蛋白表达量与单株铃数、单铃体积和单铃干重呈极显著负相关。由此说明棉纤维中Bt蛋白的表达与棉铃的生长发育有极显著的负相关关系，棉铃太大、太多，均不利于棉纤维中Bt蛋白的表达。因此，在育种和栽培时需协调好棉铃发育和Bt蛋白表达的关系。

表6 棉纤维Bt蛋白表达量与棉铃生长系数的相关性Table 6 Correlation analysis between the content of Bt protein in fiber and parameters of boll growth

棉纤维Bt蛋白表达量与氮代谢主要物质含量和关键酶活性的相关分析(表7)表明，2个Bt棉品种纤维中Bt蛋白表达量与可溶性蛋白含量、GPT和GOT活性均呈极显著正相关关系,与游离氨基酸含量、蛋白酶和肽酶活性呈极显著负相关关系。由此可见，棉纤维中Bt蛋白含量的变化与氮代谢合成和分解过程密切相关，这也说明棉铃成铃强度和棉铃大小的变化引起了棉铃氮代谢的生理变化，从而导致 Bt 蛋白表达量的变化，影响了抗虫性。因此，调节棉铃发育的氮代谢生理强度，对于协调棉铃发育和抗虫性具有重要意义。

表7 棉纤维中Bt蛋白表达量与氮代谢主要物质含量和关键酶活性的相关性Table 7 Correlation analysis between the content of Bt protein in fibers and the contents of main substances of nitrogen metabolism and the activities of key enzymes

3 讨论

3.1 高种植密度抑制棉铃生长发育，提高棉纤维Bt蛋白含量

研究表明，棉花产量受密度的影响[18]，在最适种植密度下，可以获得最高的皮棉产量，而最适种植密度与品种特性、当地气候条件和耕作制度等有关[25-26]。通过调整种植密度能有效控制棉铃的发育并促进集中成铃[27-29]。此外，棉铃在植株上的分布也受密度的影响，在较高密度下，内围成铃数增加，外围成铃数减少[16,18]。因此，在棉花生产中，通常采用调整密度来影响株形和棉铃的生长发育，以达到控制产量和产量分配的目的。另一方面，Wang等[30]通过剪叶、去蕾等栽培措施形成了不同体积的棉铃，棉铃体积越大，铃壳和棉籽中Bt蛋白表达量越低。另外，有研究表明，施氮量越高，单株铃数、单铃体积和铃重等生理参数越大，而棉壳中Bt蛋白表达量越低，棉壳中Bt蛋白表达水平与棉铃生长参数呈显著负相关关系[20]。本研究结果表明，种植密度对棉纤维中Bt蛋白表达量有显著影响，高密度种植下棉纤维中Bt蛋白含量较高，在最高种植密度下(7.5万株·hm-2)棉纤维中Bt蛋白的表达量最高。种植密度与Bt蛋白表达量呈正相关关系。提高种植密度在提高Bt蛋白表达量的同时，显著降低了铃重、铃体积和单株铃数。即密度变化导致了棉铃生长发育的变化，最终引起了棉纤维中Bt杀虫蛋白表达量的变化。相关分析进一步证实棉纤维中Bt蛋白表达量与单株铃数、单铃体积和铃重等显著负相关。因此，植株密度通过对铃数、铃重、铃体积等的影响，从而提高了棉纤维中Bt蛋白表达量，与前人研究结果基本一致。

3.2 不同种植密度下棉纤维中Bt蛋白含量与氮代谢的关系

Zhang等[4]研究表明极端湿度显著影响棉花叶片氮代谢，从而导致叶片中Bt蛋白表达量发生变化。Wang等[13]研究发现高温胁迫下Bt蛋白表达量与氮代谢强度密切相关，高温下叶片Bt蛋白表达量的下降是蛋白质合成能力下降和分解能力增强综合作用的结果。盐胁迫也会影响Bt棉叶片中的氮代谢，从而降低叶片中Bt蛋白表达量[4]。增施氮肥能够提高Bt蛋白表达量，而减施氮肥会降低Bt蛋白表达量，即氮肥用量引起的Bt蛋白表达量变化与氮代谢生理密切相关。因此，Bt蛋白表达量与棉花氮代谢密切相关。本试验表明，提高种植密度会显著降低棉纤维中蛋白酶和肽酶的活性，但显著提高GPT和GOT活性。同时随着密度的增加，棉纤维中游离氨基酸含量下降，可溶性蛋白含量增加。由此表明，在高种植密度下，蛋白质合成增强，分解减弱。相关性分析进一步表明，棉纤维中Bt蛋白表达量与可溶性蛋白含量、GPT和GOT活性呈显著正相关；但与游离氨基酸含量、蛋白酶和肽酶活性呈显著负相关。因此，高密度下Bt蛋白表达量的提高与氮代谢密切相关，是蛋白质合成增强和降解减弱综合作用的结果。

当前生产中，我国南方棉区以杂交种应用为主，育种目标以大铃型品种为主导。体积膨大期是棉铃虫危害棉铃的主要时期，综上所述，单纯追求棉铃增大将不利于抗虫性的提高。因此，在促进棉铃增大的同时，需要协调棉铃中 Bt 蛋白的表达。这就要求育种中进行大铃 Bt 棉新品种的培育时，宜选择棉铃氮代谢生理强度高的材料；同时在栽培管理过程中，应注重提高棉铃的氮代谢生理强度，以协调形成大铃和抗虫性间的关系。