高效液相色谱法同时测定鸭跖草中的3种有效成分

邱连建，王 银，陈会朋

[北京中医药大学深圳医院（龙岗），广东 518033]

鸭跖草收载于《中国药典》一部，为鸭跖草科植物鸭跖草Commelina communisL.的干燥地上部分，夏、秋二季采收，晒干。本品甘、淡，寒，归肺、胃、小肠经。具有清热泻火，解毒，利水消肿的作用。用于感冒发热，热病烦渴，咽喉肿痛，水肿尿少，热淋涩痛，痈肿疔毒［1］。鸭跖草中主要含有黄酮类、生物碱、酚酸类成分［2-8］。

其中的黄酮类成分具有一定的药理活性，如文献报道芦丁具有抗氧化、血管舒张、抗病毒、抗急性胰腺炎等作用［9］，牡荆苷具有心脑血管保护、抗肿瘤、抗病毒、降压、抑菌、抗炎镇痛等作用［10］，荭草苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、保肝等作用［11］。有效成分的化学结构见图1。

图1 有效成分的化学结构

《中国药典》中未对其含量进行控制，文献中也有对其部分成分进行测定报道［12-14］。本文首次采用高效液相色谱法对鸭跖草中异牡荆素、芦丁和异荭草苷3种有效成分进行测定，建立了HPLC法同时测定鸭跖草中的3种有效成分，为鸭跖草的质量研究提供参考。

1 仪器与材料

1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），Welchrom C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm，上海月旭公司），BK2000超声波清洗器（济南巴克公司）；BD303型十万分之一天平（德国赛多利斯公司）；甲醇、庚烷磺酸钠与乙腈均为色谱纯（天津希恩斯）。芦丁对照品（批号100080-202012，含量以91.6%计，购自中国食品药品检定研究院）；异荭草苷对照品（批号111974-201401，含量以94.0%计，购自中国食品药品检定研究院）；异牡荆素对照品（批号20200903，含量以98.0%计，购自天津一方科技有限公司）；七批药材的批号分别为20200922（产地：吉林长春）、20200928（产地：江西樟树）、20201016（产地：安徽绩溪）、20201122（产地：湖北襄樊）、20201212（产地：四川泸县）、20201225（产地：辽宁大连）、20201226（产地：山东临沂）采购于安徽亳州中药材批发市场，经深圳市中医院陈香玲老师鉴定为鸭跖草Commelina communisL.的干燥地上部分。

2 方法

2.1 色谱条件 所用色谱柱为Welchrom C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相A相为乙腈-甲醇（1∶1），流动相B相为5 mmol/L庚烷磺酸钠水溶液，进行等度模式与梯度模式混合洗脱：0～5.0 min，85% B；5.1～25.0 min，85%→70% B；流速为0.7 ml/min；检测波长为350 nm；柱温45℃；进样量10 μl。

2.2 溶液的制备方法

2.2.1 对照品溶液 分别称取异牡荆素对照品、芦丁对照品和异荭草苷对照品适量，将甲醇作为稀释剂，超声溶解，定容至刻度，混合均匀，制备成含异牡荆素50 μg/ml、芦丁20 μg/ml和异荭草苷200 μg/ml的溶液，即得对照品储备液1。分别称取异牡荆素对照品、芦丁对照品和异荭草苷对照品适量，将甲醇作为稀释剂，超声溶解，定容至刻度，混合均匀，制备成含异牡荆素160 μg/ml、芦丁80 μg/ml和异荭草苷320 μg/ml的溶液，即得对照品储备液2。取对照品储备液2，精密移取1 ml，置于10 ml量瓶中，甲醇定容至刻度，混合均匀，制备成含异牡荆素16 μg/ml、芦丁8 μg/ml和异荭草苷32 μg/ml的溶液，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取鸭跖草药材进行粉碎处理，称取粉碎物约1.0 g，置100 ml烧瓶中，加入70%乙醇50 ml进行回流提取，回流提取的时间为3 h，溶剂蒸干，放冷，加甲醇进行溶解，定容至25 ml，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 系统适应性试验 取对照品溶液，置于2 ml进样小瓶中，在“2.1”色谱条件下，液相色谱仪自动进样10 μl，记录相关的色谱图。异牡荆素、芦丁和异荭草苷3种成分均能够有效分离，分离度均大于1.5，3中成分色谱峰的理论塔板数均大于5 000。色谱图见图2。

图2 空白对照(A)混合对照品(B)供试品(C)HPLC图谱

2.4线性试验 取对照品储备液1，分别精密移取1、2、5、10、15和20 ml，置于20 ml量瓶中，以甲醇作为稀释剂，定容至刻度，摇匀，即得不同浓度的线性溶液，分别置于2 ml进样小瓶中，在“2.1”色谱条件下，液相色谱仪自动进样10 μl，记录相关的色谱图。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性试验，线性方程与线性范围见表1。

表1 3种成分的线性数据

2.5 精密度试验 取“2.2.1”项下制备的对照品溶液1份，置于2 ml进样小瓶中，在“2.1”色谱条件下，液相色谱仪自动进样10 μl，重复进样6次，记录相关的色谱图。试验结果表明，异牡荆素、芦丁和异荭草苷3种有效成分的RSD值分别为0.44%、0.68%与0.35%，RSD均小于0.5%。试验结果表明本方法的精密度很好。

2.6 重复性试验 取“2.2.2”项下产地为吉林长春的鸭跖草（批号20200922）供试品溶液，将6份供试品溶液分别置于2 ml进样小瓶中，在“2.1”色谱条件下，液相色谱仪自动进样10 μl，记录相关的色谱图。异牡荆素、芦丁和异荭草苷3种有效成分的RSD值分别为1.37%、1.03%与0.88%。试验结果表明该方法的重复性符合要求。

2.7 稳定性试验 取“2.2.1”项下制备的对照品溶液1份，置于2 ml进样小瓶中，在不同的时间点（0、2、4、6、8、12、24和48 h）进行测定，在“2.1”色谱条件下，液相色谱仪自动进样10 μl，记录相关的色谱图。试验结果表明，异牡荆素、芦丁和异荭草苷3种有效成分的RSD值分别为0.87%、0.63%与0.38%，RSD均小于1%。说明该供试品溶液在冷藏条件下48 h内是稳定的。

2.8 回收率试验 取已知3种成分含量的产地为吉林长春的鸭跖草（批号20200922）粉碎物9份，每份约1 g，按照“2.2.2”项下进行供试品溶液的制备，分别制备供试品溶液，9份供试品溶液分别精密加入高、中、低3个水平的对照品溶液，每个水平3份，共9份，即得试验溶液。置于2 ml进样小瓶中，在“2.1”色谱条件下，液相色谱仪自动进样10 μl，记录相关的色谱图，对计算结果进行回收率计算。结果表明异牡荆素、芦丁和异荭草苷3种有效成分的RSD值分别为1.24%、1.34%与0.80%，RSD均小于2%，回收率分别为99.47%、100.72%与100.22%。说明该方法的准确度良好，见表2-4。

表2 异牡荆素回收率试验结果（n=9）

表3 芦丁回收率试验结果（n=9）

表4 异荭草苷回收率试验结果（n=9）

2.9 样品测定结果 基于前期的方法学验证，表明该分析方法是准确的。对于不同产地的药材进行3种成分的测定。按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别置于2 ml进样小瓶中，在“2.1”色谱条件下，液相色谱仪自动进样10 μl，记录相关的色谱图，按外标法进行计算。结果表明3种成分由于产地的不同略有差异，特别是异荭草苷的含量差异比较明显。测定结果见表5。

表5 3种成分的测定结果

3 讨论

本文建立的高效液相色谱法测定鸭跖草中3种有效成分的分析方法，通过全面的分析方法验证，表明该方法可以应用于鸭跖草的质量研究。

3.1 提取工艺优化

3.1.1 提取溶剂 基于《中国药典》［1］和文献［12-14］，本文采取回流提取的方式，在提取溶剂的选择上进行了较为系统的考查，分别对甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇和70%乙醇进行了考查，优选70%乙醇作为提取溶剂。

3.1.2 提取时间 确定提取溶剂后，对回流提取的时间进行了考查，分别考查了0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 h。当提取时间为3 h的时候，提取效率达到最高，3种成分的含量达到最大值，当提取时间大于3 h的时候，提取效率基本没有变化，3种成分的含量没有增加。

3.2 色谱条件优化

3.2.1 流动相种类 对于流动相的筛选，主要基于文献的相关数据，分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-乙酸、乙腈-磷酸、乙腈-庚烷磺酸钠和甲醇-乙腈-庚烷磺酸钠，优选甲醇-乙腈-庚烷磺酸钠体系，进一步确定了离子对的浓度［12-14］。

3.2.2 色谱柱温度 色谱柱温度对于该方法有比较大的影响，温度越高分离效果越好，鉴于温度过高会对色谱柱造成损伤，本文优选45℃度作为最终的柱温，在柱子温度为45℃时，异牡荆素与异荭草苷的分离度达到1.5以上。

3.2.3 色谱柱填料 对于不同的色谱柱填料进行了选择，包括苯基柱、氨基柱、C30、C8、C18等，优选十八烷基硅烷键合硅胶填料，进一步对不同厂家的色谱柱进行筛选，最终选择Welchrom C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），使用该类型的色谱柱，异牡荆素与异荭草苷的分离度可以达到2.0以上。